蛋白A高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G的含量(精)

蛋白A 高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白G 的含量周冬梅邹汉法**杨利贾凌云张玉奎(中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011提要研究了蛋白A 高效亲和膜色谱对水溶液及人血浆中人免疫球蛋白G (HIgG 的特异性吸附和定量测定。

方法具有较高的精确度和较好的重复性:HIg G 标样5次重复进样的相对标准偏差为1. 5%, 人血浆样品3次重复进样的相对标准偏差为3. 6%; 所测得的定量标定曲线的线性相关系数达到0. 9993; 不含己二胺间隔臂的亲和介质的非特异性吸附极低, 基本检测不出来。

快速实验中, 一次分析可在0.5min 内完成。

实验表明, 利用所建立的方法对人血浆中的HIgG 进行定量测定可以得到较为满意的结果。

关键词高效亲和膜色谱法, 蛋白A , 人免疫球蛋白G 分类号O 658/Q 511前言人免疫球蛋白G (HI gG 是一种活性生物大分子, 是人血浆中的主要成分之一, 通常采用免疫学的方法来对它进行测定。

蛋白A (Pr ot ein A 是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白, 分子量为42000。

在蛋白A 与免疫球蛋白G 分子的F c 区之间具有很强的特异性的亲和作用, 因而固载蛋白A 的亲和介质可用于分离、纯化和分析各种免疫球蛋白G [1～4]。

我们曾采用灌流亲和色谱分析分离单克隆抗体[5, 6]。

本文采用含己二胺间隔臂和不含己二胺间隔臂两种方法合成出了以甲基丙烯酸缩水甘油酯复合纤维素膜为基质的亲和膜及以蛋白A 为配基的亲和介质, 研制出可与高效液相色谱仪配套使用的高效亲和膜色谱柱[7], 建立了一种对人血浆中的HIg G 进行定量测定的方法, 并对两种介质进行了比较; 同时对HIg G 的快速分析进行了一定的尝试。

所建立的测定方法具有简便、快速、可靠等优点, 分析一次只需5min, 快速分析只需0. 5min , 而且血浆样品不需预处理, 这是通常的免疫学方法所无法比拟的。

2实验部分2. 1仪器和试剂Wa ters 510高压液相色谱泵2台, SP 200紫外检测器1台, W DL -97色谱工作站(国家色谱研究分析中心。

蛋白A 样品由美国CU N O 公司惠赠, HIgG 标样购自军事医学科学院, 人血浆购自大连妇产医院。

其它化学试剂均为分析纯。

2. 2色谱条件膜色谱柱为20mm ×4mm i. d. ; 流动相为50mmo l /L 磷酸缓冲液含0. 15mol /L N aCl (pH 7. 0 (上样液和0. 2mo l/L 甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2. 3 (洗脱液 ; 检测波长280nm, 灵敏度0. 5A ufs 。

上样后, 先用上样液冲洗3min, 再改用洗脱液冲洗2min 。

2. 3实验方法非特异性吸附的测量:准确称量牛血清白蛋白(BSA 冻干标准品, 用上样液配制成5g/L 的溶液, 准确吸取20 L 进样, 通过色谱工作站采集谱图。

标准曲线制作:于实验前准确称量HIgG 冻干标准品, 用上样液配制成1. 25, 2. 50, 5. 00, 10. 00g /L 的标样溶液, 准确吸取每种溶液各20 L 进样, 通过色谱工作站采集谱图并对谱图积分得出峰面积。

以峰面积对进样量作线性拟合, 得出定量标定曲线。

重复性的考察:将HI gG 标样溶液连续5次重复进样20 L , 将稀释10倍的血浆样品连续3次进样, 考察峰面积的重复性。

血浆样品测定:血浆样品不需特别的预处理, 于实验前将冷冻保存的血浆样品于37℃的水浴中解冻, 再用上样液将其稀释10倍。

准确吸取20 L 进样, 通过色谱工作站采集谱图, 在标准曲线的线性范围内用峰面积外标法定量。

3结果与讨论3. 1两种亲和介质的非特异性吸附的比较两种亲和介质分别为含己二胺间隔臂和不含己第16卷第3期色谱V o l. 16N o. 3本课题获国家自然科学基金资助**::二胺间隔臂的高效亲和膜介质, 它们的非特异性吸附的谱图如图1所示。

由图1可见, 含间隔臂的亲和介质对BSA 有一定的非特异性吸附, 经色谱工作站积分可得, 当BSA 上样量为100 g 时, 含间隔臂的亲和柱对BSA 的非特异性吸附约为2 g ; 而不含间隔臂的亲和柱对BSA 非特异性吸附很低, 基本检测不出来。

我们所用的基质材料是甲基丙烯酸缩水甘油酯复合纤维素膜, 本身也具有一定的疏水性, 但由实验的结果可见, 其疏水作用是较低的; 而所用的间隔臂己二胺是亲和色谱介质合成中较为常用的间隔臂, 通常可以显著提高亲和色谱介质对目标物质的亲和容量; 但它同时也是一种疏水色谱的配基, 分子中含有6个碳原子的碳链, 分子中的氮原子与配体间又具有一定的非特异性的电荷作用, 因而含有间隔臂己二胺的介质的非特异性吸附较大。

图1含间隔臂(a 及不含间隔臂(b 的亲和膜分析柱对牛血清白蛋白的非特异性吸附Fig . 1Non -specific adsorption of BS A with arm of hexyldiamine (a and without the arm (b 1. 牛血清白蛋白上样谱图, 2. 空白谱图, 3. 前两个谱图相减所得的谱图。

流速:1. 0mL/min 。

1. chromatogram of BSA,2. ch romatogram of eluen t,3. ch romatogram of (1 -(2 .flow rate :1. 0mL /min .3. 2标准曲线的制作按上述方法在不含间隔臂的膜亲和柱上进行标准曲线的测定。

将所得的HIg G 标准样的峰面积(S 对进样量(W 进行线性拟合, 所得的定量标定曲线见图2, 它的线性方程为S =4. 9×105+2. 5×104W , r =0. 9993。

图2HIgG 的定量标定曲线Fig . 2Calibration curve of HIgG3. 3重复性的考察同一根高效膜亲和色谱柱上HI gG 标样和血浆的重复性数据见表1。

由表1可见, 它们重复进样的表1方法的重复性Table 1Reproducibility of the method 样品Sample 进样量Added 峰面积Area ( V ・s ×10-6 RS D (% HIg G 66 g 2. 148, 2. 078, 2. 0982. 124, 2. 1541. 5人血浆Human plas ma2 L0. 8346, 0. 9058, 0. 86743. 63. 4人血浆中HIgG 的定量测定HIg G 标样溶液和稀释10倍的人血浆上样后所得的谱图见图3-a 、图3-b, 其中第1个峰为样品中不与蛋白A 发生特异性作用的部分, 第2个峰是样品中活性HI gG 组分。

由血浆上样谱图中HIgG 谱峰的峰面积和定量标准曲线可得所取血浆样品中活性HIg G 的含量为7. 9g /L 。

由于冲洗液对紫外吸收的影响, 使得所做的定量标准曲线没有过零点; 若采用单点定量, 待测物的峰面积与标准品的峰面积必须相近才可以, 所以最好是采用标准曲线定量。

3. 5人血浆中HIgG 的快速测定将流速提高到3. 0mL /min 并相应改变冲洗梯度, 可使1次分析的时间缩短到0. 5m in , 使得在线・196・色谱16卷HIgG 标样和稀释10倍的人血浆样品所得的谱图。

利用所做的快速定量标准曲线, 可以进行快速的定量。

图3以蛋白A 为配基的亲和膜分析柱上HIgG (a , c及稀释10倍的人血浆(b , d 样品的分离谱图Fig . 3Chromatograms of HIgG (a , c anddiluted human plas ma (b , d 峰(Peak :1. 不纯物(impurity , 2. HIgG 。

流速(flow rate :a, b. 1. 0mL/min; c, d. 3. 0mL/m in 。

4结论亲和膜色谱法具有特异性高、速度快等优点, 多应用于复杂的生物活性大分子的纯化分离, 在分析中的应用尚少。

本文建立的蛋白A 高效亲和膜色谱法可以方便快速的定量测定组成复杂的人血浆样品中的HIg G , 重复性好, 准确度高, 并且血浆样品不需特殊的处理, 是一种较为实用的方法。

利用蛋白A 高效亲和膜色谱法还可以对其它各种免疫球蛋白G 及各种单克隆、多克隆抗体进行定量测定。

同时还可在膜基质上固载抗原抗体等其它的配基, 并对相应的活性生物大分子进行定量测定。

理论上任何一种活性生物大分子物质均可通过亲和色谱法得到分离, 因而这种定量测定的方法具有广阔的发展前景。

参考文献1Langone J J. J Immunol M ethods , 1982, 55:277-2962Denizli A, Rad A Y, Pis kin E. J Chromatogr B, 1995,668:13-193Langone J J , Boyle M D P , Borsos T . J Imm unol ,1978, 121:327-3314Boyle M D P, Langone J J. J Immun ol M eth ods, 1980,32:51-585Zou H, Zhang Y, Lu P. Biomed Chr om atogr, 1996, 10:78-826Zou H, Zhang Y, Lu P. Biomed Chromatogr, 1996,10:122-1267邹汉法, 周冬梅, 杨利等. 高效亲和膜色谱分析用介质及其合成方法. 中国专利, 97111908. 2. 1997-06-25Determination of HIgG in Human Plasma by High PerformanceMembrane Affinity Chromatography (HPMACZhou Do ng mei , Zo u Hanfa *, Yang Li , Jia Ling yun and Zhang Yukui(N ational Chr omatograp hic R . &A . Center , D alian I ns titute of Chemical Phy sics ,T he Chinese A cademy of Sciences , D alian , 116011Abstract A n assa y technique fo r determina tio n of Human Ig G in human plasma has been developed by utiliz-ing P ro tein A bound t o the modified cellulo se ma trices based on the stro ng affinity betw een pro tein A and Fc reg io n of IgG. T he pH v alues o f loading buffer and elut ion buffer w ere 7. 0a nd 2. 3r espectiv ely. T he car -tr idg e used w as 20mm ×4mm i. d. a nd detection wa s car ried out w ith a U V monito r at 280nm. T he non-spe-cific adso rption of t wo kinds of m edia has been studied . T he media w itho ut hex y ldiamine ar m gives ver y low non-specific adso rption BSA. T hecalibr ation cur ve sho wed a g oo d linearity (co rr elatio n coefficient >0. 9992 in the inject ed amount r ang e of 9-70 g for HI gG. T he to tal t ime for separ atio n and deter mination was w ithin 5min and the to tal time o f rapid assay w as within 30s. Relat ive standard dev iatio ns o f peak areas w ere 1. 5%(n =5 and 3. 6%(n =3 for HIg G in standard solut ion and human plasma r espectively . Key words hig h perfo rmance membrane affinity chr omato gr aphy, pr otein A , HIgG・197・3期周冬梅等:蛋白高效亲和膜色谱法测定人血浆中免疫球蛋白的含量。