应重视马兜铃酸肾病易感机制的研究

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应重视马兜铃酸肾病易感机制的研究

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阳 晓

曾又佳

* 本课题为国家自然科学基金资助项目(No.30873432)

中山大学附属第一医院肾内科,卫生部重点实验室 (广州 510080)

阳晓,医学博士,教授,博士研究生导师,博士后合作导师。现任中山大学附属第

一医院肾内科主任、中山大学中西医结合研究所副所长。兼任中国中西医结合学会理事,中国中西医结合学会肾脏病专业委员会常委,广东省中西医结合肾病专业委员会副主任委员,!J Nephrol Renal Transplant ∀!中华肾脏病杂志∀、!中国中西医结合肾病杂志∀、!中国血液净化∀等杂志编委,!Rheumatology ∀、!Clinic Nephrol ∀等杂志审稿人。主要研究方向为腹膜透析和中西医结合肾脏病的防治,曾先后以访问学者及临床观察员身份分别在希腊Al.Flem ing 生物医学科学研究中心及加拿大多伦多大学进修。近年来主持各级科研课题15项,其中国家自然科学基金4项;在!Nephrol Dial T ransplant ∀、

!Am J Nephrol ∀、!Lupus ∀、!Cy tokine ∀等SCI 收录杂志发表论文20篇。获国家科技进步二等奖1项、部省级科技成果奖7项;获广东省优秀博士后、广东省#千百十人才工程∃先进个人、国际腹膜透析学会(ISPD)#Yong Investigator Grant ∃和#Travel Grant ∃奖等荣誉。 马兜铃酸肾病(AAN)是一种慢性间质性肾脏疾病,其发病与摄取含马兜铃酸的中草药密切相关。目前发现马兜铃酸也是巴尔干肾病的主要致病因素[1]。即便如此,#每年有成千上万人服用中草药,为什么仅少数人出现肾脏损害∃[2]?#据估计,暴露于高浓度马兜铃酸(AA)后,仅有1/20人群产生病变∃[3]。并不是所有服用含AA 中草药(植物)者都发生AAN,这一不争事实后面蕴藏的易感差异机制困惑着国内外中、西医工作者。目前有关AAN 个体易感差异的机制研究报道甚少。阐明AAN 个体易感性及其进行性发展的病理生理机制,不仅对于正确认识AAN 具有重要的现实意义,而且对于合理使用中草药,预防中草药相关性肾损害具有重要的现实意义。 1 马兜铃酸类中药的药性理论

有毒无毒是中药药性理论的重要组成部分。有效性和毒性是绝大多数药物包括中药在内同时具有的双重特性,关键是合理用药。中药的使用是以整体观念、辨证论治为原则,按照中药药性理论正确选药,合理配伍组方,其中配伍讲究#君臣佐使∃,避免配伍禁忌,如#十八反∃、#十九畏∃等;在用药过程中强调因人因地因时施治的个体化治疗。其目的是增加疗效,减少毒副作用发生。含有AA 的利水渗湿、祛风胜湿中草药治疗中医水肿、痹症等顽症具有特殊疗效,但

使用过程中需辨证施治,注意用药宜忌。!本草新编∀指出:#木通,逐水气,利小便,亦佐使之药,不可不用,而又不可多用,多用则泄人元气。∃!本草经疏∀亦指出防己#凡胃虚阴虚,自汗盗汗,口苦舌干,肾虚小水不利,及胎前产后血虚,虽有下焦湿热,均忌∃。提示阴亏津少、肾虚遗精遗尿者,慎用利水渗湿药。古代医家已认识到药物剂量过大、患者体质因素及证候性质与中药不良反应的产生有关。目前中医认为,未按药典法定剂量给药、未按中医药理论进行准确辨证施治及未进行合理配伍是导致含AA 中草药肾毒性的重要原因。近年来国内外学者及我们临床观察均发现:许多慢性AAN 患者所服含AA 中药如关木通、广防己的剂量往往在法定剂量范围内,并非高浓度、大剂量;而且个体间易感性存在显著差异。含AA 中药导致的肾脏损伤往往多发生于存在肾脏损伤的危险因素(如高龄、腹泻、减肥等)或潜在肾脏病或某种遗传背景的基础上。提示肾脏局部存在某种机制,可能是构成AAN 易感性个体差异的重要原因之一。因此基于中药药性理论,用现代科学方法阐述AAN 个体间易感差异机制是中医药学发展及中药药性理论创新所面临的重要问题。

2 马兜铃酸肾病的病理生理机制

AAN 以快速进展的肾间质纤维化为特征。有关

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AA导致肾损伤的机制尚不十分清楚。目前认为其主要机制有[4]:AA进入肾小管上皮细胞,损伤线粒体,激活半胱氨酸蛋白酶3(Caspases3),诱导细胞凋亡; AA诱导肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,导致间质细胞外基质蓄积;AA通过形成特异性AA-DNA加合物,使DNA修复缺陷,负性影响小管上皮细胞再生,导致小管萎缩,并与肿瘤形成有关。近曲小管直部是AA肾毒性的主要靶点。用ACE I阻断肾素血管紧张素系统虽然能显著减轻巨噬细胞浸润,但并不减缓AAN肾间质纤维化进展。提示AAN导致间质纤维化不依赖RAS途径。间质区域 -平滑肌肌动蛋白阳性细胞主要是管周固有成纤维细胞及由其活化的肌成纤维细胞。提示激活的间质固有成纤维细胞是AAN间质胶原沉积的主要来源。临床病理研究还发现:原发性管周毛细血管(PTC)损伤是AAN 特征之一。微血管损伤通过缺氧机制引起间质纤维化和小管损伤、萎缩,是AAN患者发生严重肾间质纤维化的始动原因之一。推测特异性PTC损伤可能是肾小管间质浓缩的AA及其代谢产物所致。体外研究显示AA可上调血管内皮细胞转化生长因子- 1 (T GF- 1)等表达,在慢性AAN血管病变中起重要作用。上述研究提示AA本身固有的毒性作用可直接损伤肾小管上皮细胞,亦可直接激活肾间质成纤维细胞、血管内皮细胞以及血管平滑肌细胞,从而导致小管间质进行性纤维化。

3 马兜铃酸类中药的体内代谢与ANN的易感机制

尽管临床和实验结果证明AA的肾毒性,但在比利时服用苗条丸的1741例患者中,仅有大约100例发生AAN。目前国内外专家已意识到AA本身毒性并不是其导致肾损伤的唯一原因。剂量过大、个体本身病理生理状况、含AA中草药与西药相互作用等均可能与AA肾毒性产生有关。动物模型研究结果显示:高剂量AA(通常10mg kg-1 d-1,大于人用剂量30倍)是建立大鼠慢性AAN的必需剂量。高剂量AA短期作用可引起肾小管上皮细胞中毒性损伤,结局是细胞凋亡和/或坏死;而低剂量AA长期反复刺激可能更易诱导纤维化和基因变异,引起组织细胞持久损伤。在AA代谢研究中,通过磷32后标记分析法分析马兜铃酸肾病患者肝、肾微粒体中NADPH,发现细胞色素P450还原酶是AAN患者产生AADNA-加合物的关键酶类,硝基还原是AAs产生肾毒性的关键。运用体外大鼠肝胞质溶胶系统(S9)和SD大鼠体内模型,发现AA在动物体内经历羟基化、内酰胺产物、去硝基化以及脱甲基等生物转化。在AAs的二期代谢中,主要有3种结合代谢产物,在浓缩的尿样中可检测到的有N端和O端马兜铃内酰胺葡萄糖醛酸苷。研究证实葡萄糖酸化是AAs代谢第二阶段,即发生硝基还原后最主要的途径。近年研究发现,肝脏的细胞色素P450酶类在AAs肾毒性中起到了关键的代谢解毒作用[5],其中以CYP1A2亚型作用最为显著。研究还发现:AA致H-ras基因突变作用发生在5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠,而接受AA的正常大鼠则未发生。提示遗传背景及个体病理生理状况在AA肾毒性易感机制中具有重要作用。

肾脏是机体分泌多种外源性及内源性有机阴离子(OA)的关键器官。许多药物、环境中的化学物质以及生物毒素都是有机阴离子,其被机体摄入后,从血液进入管周液中,在近曲肾小管上皮细胞基侧膜有机阴离子转运蛋白(OATs)作用下,跨电化学梯度转运至肾小管上皮细胞内,继而经顶膜分泌至管腔液,随尿液排出体外[5]。在这一过程中OAT1和OAT3具有关键作用,共同承担机体大部分有机阴离子的转运。AA是硝基菲羧酸类化合物,为一类典型的有机阴离子,其主要毒性成分是AA-%和AA-&。与OAT1和OAT3的标准底物对氨基马尿酸(PAH)、雌酮硫酸盐(ES)比较,同属有机羧酸类,且具备有机阴离子与OATs相互作用的两个关键要素:强净负电荷以及自身有机疏水结构,可与OATs形成稳定的氢键。AA在肾脏组织中具有蓄积性和难以清除的代谢特征[6],但其肾脏转运过程不甚清楚。我们应用细胞转染技术,将大鼠OAT1转染到HEK293细胞,观察OAT1对AA肾细胞转运的影响[7]。结果发现:特异OAT1转染细胞内AA浓度显著高于未转染细胞,且呈浓度依赖性OAT1表达细胞凋亡。用抑制剂特异性阻断OAT1,转染细胞内AA浓度降低,细胞凋亡显著减少。结果提示OAT1特异性介导AA肾细胞内转运,其高浓度细胞内蓄积导致细胞损伤。新近德国Bakhiya等[8]通过转染HEK293使其稳定表达大鼠OAT1、OAT3和OAT4,发现AA%与OAT1和OAT3有很强的亲和力,能抑制OATs特征性的底物转运,该作用在OAT抑制剂丙磺酸存在的条件下则受到明显的抑制。该研究进一步证实AAs通过有机阴离子转运系统进入肾小管上皮细胞内。多个研究报道已有肾脏基础疾病如肾病患者、缺血再灌注损伤模型等,可导致肾小管上皮细胞OATs表达和功能异常[9]。我们应用免疫组化技术研究发现:慢性AAN 患者肾组织OAT1明显降低,与肾组织表皮生长因子表达低下呈正相关。结果提示OAT1表达变化参与

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