厌氧菌的分离和鉴定

人体各部位厌氧菌寄生量及其与需氧菌之比
1.正确地选择标本
下列细菌学指征有助于选择标本做厌氧培养： （1）深部伤口或软组织脓肿的脓，特别是伴 有恶臭或含有硫磺颗粒时。 （2）可疑为气性坏疽或少见的严重产气或坏 死性感染所取得的坏死组织或病灶清除材料。 （3）粘膜部位的感染灶取得的材料。 （4）从脑、肺、肝或其他器官的脓肿或从腹 腔内、肛周、隔下或其他部位的脓肿取得的 材料。
厌氧菌的分离与鉴定
卫生部北京医院
陈东科

厌氧菌检验是临床微生物检验的重要组 成部分。在无氧（或少氧）条件下，或氧化 还原电势低的条件下才能繁殖的细菌称为厌 氧菌。因为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿 生殖道正常菌群中占优势，所以当人体菌群 失调时，厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发 生严重的甚至致死的内源性厌氧菌感染。厌 氧菌感染常发生在深部伤口, 但也可伴兼性厌 氧菌和需氧菌侵犯人体任何器官和组织。所 以，对厌氧菌检验应给予高度重视。
7. 直接涂片检查
当有足够的标本或收到两个拭子时，最 好在接种前做涂片革兰染色镜检，检查结果 可提示需要接种哪些培养基（非常规使用 的）。涂片检查可看出有无细菌，微生物的 类型和大概的数量以及芽胞、形状和位置 （芽胞梭菌）、着色情况及菌体特征。对血 性液体或浓稠分泌物用丫啶橙染色比革兰染 色较易观察。这些初步结果应该及时向主管 医生报告，以帮助他们正确选用抗菌药物。 涂片检查可核对培养结果是实验室质量控制 的一个重要指标。
（1）咽、鼻、尿道或直肠拭子。 （2）咳出的痰，通过支气管镜取的分 泌物，排出或导出的尿、粪及胃内容物。

为排除或尽量减少正常菌群中厌氧 菌的污染，用注射器抽取标本比用拭子 更好，特别适用于下列临床情况：
（1）从未开放的脓肿抽取脓液。 （2）通过胸腔穿刺抽出的胸腔液。 （3）从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出或从肾 造口管收集的尿。 （4）气管切开吸取的肺分泌物。
（5）无菌区感染灶的吸出液(包括血液、 脑脊液、腹水、胸水、滑膜液、羊水等)。 （6）人或动物咬伤感染灶取得的材料。 （7）变黑的或置于紫外线发红色荧光 的渗出物。 （8）革兰染色，镜下见到具有厌氧菌 独特形态的材料。 （9）可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食 物。
2.正确地收集标本
厌氧菌是人体许多部位（如皮 肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道） 正常菌群中的一部分，因此下列材 料无需做厌氧培养：
6. 标本接种与孵育
（1）拭子和液体标本直接接种固体和液体培养基（需
氧和厌氧培养各一份），在厌氧平板上贴一片灭滴灵 纸片（5μg/片），置35℃培养。同时做直接涂片革兰 染色镜检。用铂-铱合金环（不用镍-铬合金环，因为 它可氧化接种物）三区划线接种平板，以保证长出单 个菌落。 （2）若被检标本是组织块，则立刻将其移入无菌的 组织研磨器内，用硫乙醇酸盐混合研碎，最好在厌氧 箱内或无氧条件下操作。组织匀浆接种同液体标本。 （ 3）可疑含有芽胞梭菌的标本，还要用乙醇或加热 处理后再行接种。
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__________________________________________________________ 厌氧菌数量 眼结膜 鼻涕 唾液 牙表面 牙周袋与牙垢 __________________________________________________________ （cfu\g） 103~4 101~4 108~9 109~10 1011~12 厌氧菌与 需氧菌之比 10:1 10:1 8~10:1 1:1 1000:1 __________________________________________________________ 厌氧菌数量 胃液 结肠 小肠 阴道 外尿道 皮肤 __________________________________________________________ （cfu\g） 102~5 1011~12 104~6 108~9 103~5 103~4 厌氧菌与 需氧菌之比 1:1 1000:1 1:1 10:1 10:1 10:1 __________________________________________________________
8. 厌氧菌鉴定
（ 1）灭滴灵纸片周围出现抑菌环说明有厌氧菌生长 （绝大多数专性厌氧菌对灭滴灵敏感，兼性厌氧菌耐 药）。 （ 2 ）耐氧试验：接种 BRBA 平板（需氧厌氧各放一 块）及巧克力平板（置CO2条件下）。 （ 3）革兰染色：根据菌落和菌体形态、染色特性可 初步鉴定。 （ 4 ）抗生素敏感性鉴定： BRBA 平板上分区划线接 种，第一划线区贴多粘菌素（ 10μg/ 片）、卡那霉素 （ 1000μg/ 片）和万古霉素（ 5μg/ 片）。厌氧菌纯培 养抑菌环直径>=10mm为敏感。
（5）穿刺抽出的腹腔液。 （6）通过腰椎穿刺抽出的脑脊液。 （7）窦道标本可插入小导管用注射器 吸出，注射器和针头内的气体应全部排 出，将其内容物直接注入一个已排出气 的无菌试管内。也可自窦道损伤部位取 材做活组织检查。如果必须使用拭子， 应尽快接种于适宜的培养基中。
3. 正确地运送标本
临床标本一旦离开人体部位，在进 入厌氧环境前，必须防止大气中氧的毒 性作用。应及时将取材的拭子、塑料导 管内的少量液体、吸入注射器的标本装 入厌氧生物袋或管，在运送过程中要保 持厌氧状态。培养基内不应含有肝素， 因它会抑制细菌生长。
R:耐药，S:敏感，V:不定，C:球菌，B:杆菌，CB:球杆菌，P:Prevotella;*甲酸、延胡素酸盐刺激生长阳性
表4-3 Ⅱ级水平实验室革兰阳性厌氧菌群、属、种鉴定
_______________________________________________________________________________________________________________ 厌氧菌种类 细胞 已醇芽 卡那 多粘 万古 靛基质 硝酸盐 触酶 卵磷 反向CA 菌体列车 双环β 尿素酶 形态 胞试验 霉素 菌素 霉素 还原 脂酶 MP试验 状排列 溶血现象 _______________________________________________________________________________________________________________ 厌氧革兰阳性球菌 C — V R S V S 厌氧消化球菌 C/CB — R R S — —+ V 不解糖消化球菌 C — S R S + 梭状芽胞杆菌属 B + V R S V 奈格尔试验阳性梭芽胞菌 B + S R S + 产气荚膜梭菌 B + S R S — + + + + 双酶梭菌 B + S R S — + — — — — 索氏梭菌 B + S R S — + — — — + 奈格尔试验阴性梭芽胞菌 B + S R S V 难辩梭菌 B + S R S 无芽胞厌氧菌 CB/B — S R S 痤疮丙酸杆菌 B — S R S +++迟缓真杆菌* CB/B — S R S — + — _______________________________________________________________________________________________________________ _ R:耐药，S:敏感，V:不定，C:球菌，B:杆菌，CB:球杆菌， *精氨酸刺激试验：阳性
4. 使用新配制的培养基
初代接种厌氧菌最好使用新配制的 培养基。 平板培养基无需在厌氧条件下 贮存，用前可进行预还原，但厌氧条件 下贮存可延长培养基的有效期。
5. 提Hale Waihona Puke Baidu可靠的厌氧环境
使用厌氧罐法、厌氧袋法或厌氧箱 法。在厌氧培养中必须使用氧化还原指 示剂，一般采用亚甲基美兰或刃天青， 每次要新鲜配制。如果能在孵育的整个 过程中维持厌氧条件，指示剂溶液将无 色，否则指示剂则变色。
表1 Ⅱ级水平实验室革兰阴性厌氧菌群、属、种鉴定
_________________________________________________________________________________ 厌氧菌种类 细胞 卡那 万古 多粘 20% 靛基质 脂酶 硝酸盐 尿素酶 动力 凹痕 砖红色 形态 霉素 霉素 菌素 胆汁 还原 荧光 _________________________________________________________________________________ 脆弱类杆菌群 B R R R + V — — + 其他类杆菌 B R R V — V — — — 产色素杆菌. R V V — V V P.中间型杆菌 CB/B R R S — + ++P loescheii R R V — — —+ 类解脲类杆菌群 S R S — — — + V V V — 解脲类杆菌. B S R S — — + + — V 梭状肛菌属 S R S V V V — 革兰阴性球菌 C S R S V 韦荣球菌属 C S R S + —+ _________________________________________________________________________________