圆二色光谱仪原理应用

圆二色性光谱及其应用
（Circular Dichroism，CD）
光学活性分子对左、右圆偏光的吸收率的差值
1、自然光
光具有波、粒二象性，是横电磁波。

只有横波才有偏振现象:
光矢量的振动方向与光的传播方向垂直，
在垂直于光传播方向的平面内, 有不同的振动方向。

电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、位相相同。

由于感光作用都是E 引起的，因而，将E 作为光矢量。

振动面：E 与光传播方向组成的平面。

从统计规律上说，自然光的光振动:
在垂直于光速的平面上遍布所有方向，
沿各方向振动的光矢量呈对称分布,
相应光矢量的振幅（光强度）相等。

超高压短弧氙灯: 在高压纯净氙气中放电发光。

（1）高亮度的点光源；
（2）日光色。

色温接近6000K；
（3）在可见光区连续光谱；
（4）高显色性，显色指数＞95；
（5）在整个寿命期内维持光色特性；
（6）高电弧稳定性；
（7）热重启能力；
（8）启动后即能达到接近最大光输出；
（9）电弧光斑小、易聚光。

2、光的偏振
双折射现象：
一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。

尼科耳棱镜。

在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。

o光和e光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光
光的吸收和圆二色性（circular dichroism, CD）
化合物在正常情况下，处于低能的基态，电子占据所有的成键轨道（σ、π、n轨道）。

如果电子吸收了外界的能量，它就从基态跃迁到激发态能
级。

如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄而不连续的谱线。

由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰值，但都是具有一定
波长宽度并相对平滑的曲线。

应用
氨基酸的圆二色性
•可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。

•紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。

•氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。

肽的圆二色谱
活性肽构象与其生理功能的关系
肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。

肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。

Far-UV (250-170nm)
Tertiary Structure Class: all-α, α+β, α/β, all-βI, all-βII
Near-UV (320-250nm)：
Near-UV ~ Near-infrared (300-1000nm)：
colored proteins
芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区表现出CD信号苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）：255、261和268nm附近；
酪氨酸（tyrosine，Tyr）：277nm左右；
色氨酸（tryptophan，Trp）：279、284和291nm附近；
二硫键的变化反映在整个近紫外区。

Far UV CD spectra of poly-L-Lys
Main CD features of protein 2ndary structures
- band (nm) + band (nm)
192
α-helix 222
208
β-sheet 216 195
205
β-turn 220-230 (weak)
180-190 (strong)
polypro II helix 190 210-230 weak Random coil 200 212
3、估算蛋白质二级结构含量
仅适合 含量较高的蛋白质！
未知结构的蛋白的CD信号
•将测得的CD曲线与标准曲线拟合。

x a+ x b + x c = 1.0
q t = x a q a + x b q b + x c q c
•改变x a、x b和x c，使q t与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，least squares minimization）
•CD signal of a protein depends on its 2ndary structure
磁圆二色谱
（Magnetic Circular Dichroism ，MCD）
•磁性材料对左、右圆偏光的吸收不同而产生的二色性现象。

利用法拉第效应，在外加磁场的作用下，许多原来没有光学活性的物质也具有了光学活性，原来可测得CD谱的，在磁场中CD信号可增大几个数量级。