植块法成骨细胞体外培养方法改良论文

植块法成骨细胞体外培养方法的改良【摘要】目的：对成骨细胞体外培养改良植块法的可行性进行观察。方法：应用改进的植块接种培养技术进行成骨细胞的分离培养，通过细胞形态学、碱性磷酸酶（alp）细胞化学染色、骨钙素（bgp）免疫细胞化学染色、钙化结节的形成四方面对成骨细胞进行鉴定。结果：(1)原代及传代细胞均贴壁生长，呈三角形、多角形、梭形等不规则形态，条件培养基中形成钙化结节，碱性磷酸酶细胞化学染色及骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性。结论：改进的植块接种培养法可获得成骨细胞，缩短成骨细胞的培养周期。

【关键词】成骨细胞 ;体外培养 ;方法 ;改良

【中图分类号】r329 【文献标识码】a【文章编号】1044-5511（2011）11-0453-02

近20年来随着细胞生物学及生物材料学技术的发展而出现了一门新的边缘学科——骨组织工程学。骨组织工程学研究的方向主要在：种子细胞及载体材料两方面。种子细胞主要来源是骨外膜成骨细胞［1］、松质骨组织中的成骨细胞［2］、软骨细胞［3］及骨髓基质细胞［4］。传统的成骨细胞体外培养方法需多次传代，具有耗时、易污染的缺点，我们对体外培养方法进行了改良，现总结如下：

一、材料与方法

1实验动物：健康新西兰大白兔（赣南医学院实验动物中心提供，体重1.5-2kg）

2、主要试剂及仪器：胎牛血清（华美生物工程公司）

dmem（gibco）

胰蛋白酶（gibco）

edta（gibco）

青霉素g钠盐（华美生物工程公司）

链霉素（华美生物工程公司）

骨钙素抗体（解放军总医院放免研究所）

sabc试剂盒（博士德公司）

倒置显微镜（olympus）

低温冰箱（indesit）

二氧化碳细胞培养箱（forma scientific）

3、兔成骨细胞的植块接种原代培养及传代：组织块的来源是新西兰大白兔的肋骨，无菌操作下采取骨组织块，在无菌室内进行植块前的处理：去除肋骨四周的软组织（包括骨膜及软骨）及将肋骨剪成1mm×1mm×1mm大小的骨组织块，用中性d-hanks液反复冲洗组织块，直至液体清亮为止。将组织块均匀植入预先涂抹薄层血清的50ml培养瓶底，间隙为0.5~1cm左右。将已植入组织块的培养瓶倒转，铺满组织块的培养瓶底朝上，向瓶内加入4ml含10%胎牛血清、维生素c50μ g/ml、维生素k310nm/ml、青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml的dmem培养液。盖上胶塞，在密封条件下，放入37℃培养箱内放置3-4小时后，将培养瓶轻轻翻转，让培养液浸没组织块，继续放置在37℃恒温培养箱中静置培养。36小时后，将培养瓶中的培养液吸去，加入无胎牛血清的dmem培养液（其他

成份同前）。轻轻吹打成细胞悬液。加入胎牛血清至10%的浓度，按1:3的比例接种到50ml培养瓶中。置入37℃培养箱中，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况。每2日换培养液一次。待细胞长成单层后，进行传代。先将原培养液吸去，d-hanks轻轻漂洗细胞层2次，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%edta混合消化1-2分钟，吸去混合消化液，d-hanks再次漂洗3遍，加入无胎牛血清的dmem培养液，吹打成细胞悬液，加入胎牛血清至10%浓度，1:2的比例传代培养。

4、传代成骨细胞的贴壁纯化:根据成纤维细胞较成骨细胞贴壁快的特点，去除成纤维细胞，将原代成骨细胞消化制成细胞悬液依次接种入三个培养瓶，每瓶静置时间为30分钟左右。第三瓶为传代生长细胞，放置恒温培养箱。

5、成骨细胞的鉴定

5.1倒置显微镜下形态观察

5.2碱性磷酸酶细胞化学染色:在即将传代的培养瓶底，平铺洁净的盖玻片。待传入的细胞在玻片上贴壁生长近单层后，取出玻片。中性pbs漂洗3次，95%乙醇固定10分钟，细胞爬片标本浸没在孵育液，放置在37℃温箱中孵育4小时。然后2%硝酸钴液和1%硫化铵溶液处理，0.15%伊红复染后，晾干，待观察。

空白对照组中的孵育液中不加β-甘油磷酸钠，以蒸馏水替代，其他条件均相同。

5.3骨钙素免疫细胞化学染色:标本采集同碱性磷酸酶染色组，

免疫细胞化学染色：试剂为兔抗人的骨钙素抗体，工作浓度为

1:300，空白对照组以0.01mol/l pbs代替一抗。

(1)pbs洗涤标本3×3分钟。

(2)1%甲醇过氧化氢封闭30分钟。

(3)羊血清孵育30分钟。

(4)滴加一抗4℃环境中过夜。

(5)pbs洗涤3×3分钟。

(6)滴加羊抗兔1gg二抗 37℃20分钟。

(7)pbs洗涤3×3分钟。

(8)加sabc（三抗）37℃20分钟。

(9)pbs洗涤3×3分钟。

(10)dab显色，镜下控制显色时间。

5.4钙化结节的形成:在原dmem培养液中加50mg/l l-抗坏血酸、10nmol/l地塞米松和10mmol/l β-甘油磷酸钠的环境中，成骨细胞可形成钙化结节。

二、结果

1.原代及传代细胞的形态学观察：在原代培养24小时时，倒置显微镜下见骨组织块四周有细胞游出，呈拥挤状态，数量较多（附图1），贴壁生长后，早期为圆形、短梭形、三角形或其他不规则形（附图2）。第36小时后游出的细胞接种到培养瓶中（附图3），接种10-12小时，即可贴壁生长，伸出较多突起，胞核居中。随着培养时间延长，细胞突起伸长，核仁也变得清晰可见（附图4）。12-14

天后，原代细胞长成单层，梭形细胞排列紧密，高倍镜下可见有重叠生长（附图5、附图6）。传代细胞10小时开始贴壁（附图7）。5-6天后可长成单层，呈长梭形或多角形,光镜下形态与原代细胞无差异（附图8）。

2.成骨细胞的鉴定

2.1形态学观察（见上述-附图2）

2.2碱性磷酸酶染色：经钙一钴法染色，92﹪以上的细胞呈阳性反应，为黑色斑块状或颗粒状沉淀物，位于胞浆中（附图9）。空白对照片为阴性反应，仅为伊红复染后的红色（附图10）。

2.3骨钙素免疫细胞化学染色：经sabc法染色，阳性片呈黄褐色（附图11），空白对照为阴性（附图12）。

2.4钙化结节的形成：细胞在钙化条件下持续培养10-12天，在细胞密集后，可首先出现钙化结节，结节中心为无数颗粒状物质，分布在四周的细胞则呈放射状排列（附图13）。

三、讨论

成骨细胞的原代培养是获取组织后的首次培养。成骨细胞的原代分离培养方法，按成骨细胞分离方法的不同有酶消化法和非酶消化法。酶消化法就是应用胶原酶、胰酶等胶原溶解酶处理骨组织，借以溶解骨组织中的胶原纤维，放出沉积其中的成骨细胞，制成细胞悬液，进行接种培养，该方法要经过多次酶的消化，操作比较繁琐，作用时间难于控制，对细胞膜表面受体和抗原成分有损害作用，影响细胞功能及实验结果，但可以分离出较大的细胞量［5、6、7］。