植块法成骨细胞体外培养方法改良论文

植块法成骨细胞体外培养方法的改良【摘要】目的：对成骨细胞体外培养改良植块法的可行性进行观察。

方法：应用改进的植块接种培养技术进行成骨细胞的分离培养，通过细胞形态学、碱性磷酸酶（alp）细胞化学染色、骨钙素（bgp）免疫细胞化学染色、钙化结节的形成四方面对成骨细胞进行鉴定。

结果：(1)原代及传代细胞均贴壁生长，呈三角形、多角形、梭形等不规则形态，条件培养基中形成钙化结节，碱性磷酸酶细胞化学染色及骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性。

结论：改进的植块接种培养法可获得成骨细胞，缩短成骨细胞的培养周期。

【关键词】成骨细胞 ;体外培养 ;方法 ;改良
【中图分类号】r329 【文献标识码】a【文章编号】1044-5511（2011）11-0453-02
近20年来随着细胞生物学及生物材料学技术的发展而出现了一门新的边缘学科——骨组织工程学。

骨组织工程学研究的方向主要在：种子细胞及载体材料两方面。

种子细胞主要来源是骨外膜成骨细胞［1］、松质骨组织中的成骨细胞［2］、软骨细胞［3］及骨髓基质细胞［4］。

传统的成骨细胞体外培养方法需多次传代，具有耗时、易污染的缺点，我们对体外培养方法进行了改良，现总结如下：
一、材料与方法
1实验动物：健康新西兰大白兔（赣南医学院实验动物中心提供，体重1.5-2kg）
2、主要试剂及仪器：胎牛血清（华美生物工程公司）
dmem（gibco）
胰蛋白酶（gibco）
edta（gibco）
青霉素g钠盐（华美生物工程公司）
链霉素（华美生物工程公司）
骨钙素抗体（解放军总医院放免研究所）
sabc试剂盒（博士德公司）
倒置显微镜（olympus）
低温冰箱（indesit）
二氧化碳细胞培养箱（forma scientific）
3、兔成骨细胞的植块接种原代培养及传代：组织块的来源是新西兰大白兔的肋骨，无菌操作下采取骨组织块，在无菌室内进行植块前的处理：去除肋骨四周的软组织（包括骨膜及软骨）及将肋骨剪成1mm×1mm×1mm大小的骨组织块，用中性d-hanks液反复冲洗组织块，直至液体清亮为止。

将组织块均匀植入预先涂抹薄层血清的50ml培养瓶底，间隙为0.5~1cm左右。

将已植入组织块的培养瓶倒转，铺满组织块的培养瓶底朝上，向瓶内加入4ml含10%胎牛血清、维生素c50μ g/ml、维生素k310nm/ml、青霉素100iu/ml、链霉素100μg/ml的dmem培养液。

盖上胶塞，在密封条件下，放入37℃培养箱内放置3-4小时后，将培养瓶轻轻翻转，让培养液浸没组织块，继续放置在37℃恒温培养箱中静置培养。

36小时后，将培养瓶中的培养液吸去，加入无胎牛血清的dmem培养液（其他
成份同前）。

轻轻吹打成细胞悬液。

加入胎牛血清至10%的浓度，按1:3的比例接种到50ml培养瓶中。

置入37℃培养箱中，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况。

每2日换培养液一次。

待细胞长成单层后，进行传代。

先将原培养液吸去，d-hanks轻轻漂洗细胞层2次，加入0.25%胰蛋白酶和0.02%edta混合消化1-2分钟，吸去混合消化液，d-hanks再次漂洗3遍，加入无胎牛血清的dmem培养液，吹打成细胞悬液，加入胎牛血清至10%浓度，1:2的比例传代培养。

4、传代成骨细胞的贴壁纯化:根据成纤维细胞较成骨细胞贴壁快的特点，去除成纤维细胞，将原代成骨细胞消化制成细胞悬液依次接种入三个培养瓶，每瓶静置时间为30分钟左右。

第三瓶为传代生长细胞，放置恒温培养箱。

5、成骨细胞的鉴定
5.1倒置显微镜下形态观察
5.2碱性磷酸酶细胞化学染色:在即将传代的培养瓶底，平铺洁净的盖玻片。

待传入的细胞在玻片上贴壁生长近单层后，取出玻片。

中性pbs漂洗3次，95%乙醇固定10分钟，细胞爬片标本浸没在孵育液，放置在37℃温箱中孵育4小时。

然后2%硝酸钴液和1%硫化铵溶液处理，0.15%伊红复染后，晾干，待观察。

空白对照组中的孵育液中不加β-甘油磷酸钠，以蒸馏水替代，其他条件均相同。

5.3骨钙素免疫细胞化学染色:标本采集同碱性磷酸酶染色组，
免疫细胞化学染色：试剂为兔抗人的骨钙素抗体，工作浓度为
1:300，空白对照组以0.01mol/l pbs代替一抗。

(1)pbs洗涤标本3×3分钟。

(2)1%甲醇过氧化氢封闭30分钟。

(3)羊血清孵育30分钟。

(4)滴加一抗4℃环境中过夜。

(5)pbs洗涤3×3分钟。

(6)滴加羊抗兔1gg二抗 37℃20分钟。

(7)pbs洗涤3×3分钟。

(8)加sabc（三抗）37℃20分钟。

(9)pbs洗涤3×3分钟。

(10)dab显色，镜下控制显色时间。

5.4钙化结节的形成:在原dmem培养液中加50mg/l l-抗坏血酸、10nmol/l地塞米松和10mmol/l β-甘油磷酸钠的环境中，成骨细胞可形成钙化结节。

二、结果
1.原代及传代细胞的形态学观察：在原代培养24小时时，倒置显微镜下见骨组织块四周有细胞游出，呈拥挤状态，数量较多（附图1），贴壁生长后，早期为圆形、短梭形、三角形或其他不规则形（附图2）。

第36小时后游出的细胞接种到培养瓶中（附图3），接种10-12小时，即可贴壁生长，伸出较多突起，胞核居中。

随着培养时间延长，细胞突起伸长，核仁也变得清晰可见（附图4）。

12-14
天后，原代细胞长成单层，梭形细胞排列紧密，高倍镜下可见有重叠生长（附图5、附图6）。

传代细胞10小时开始贴壁（附图7）。

5-6天后可长成单层，呈长梭形或多角形,光镜下形态与原代细胞无差异（附图8）。

2.成骨细胞的鉴定
2.1形态学观察（见上述-附图2）
2.2碱性磷酸酶染色：经钙一钴法染色，92﹪以上的细胞呈阳性反应，为黑色斑块状或颗粒状沉淀物，位于胞浆中（附图9）。

空白对照片为阴性反应，仅为伊红复染后的红色（附图10）。

2.3骨钙素免疫细胞化学染色：经sabc法染色，阳性片呈黄褐色（附图11），空白对照为阴性（附图12）。

2.4钙化结节的形成：细胞在钙化条件下持续培养10-12天，在细胞密集后，可首先出现钙化结节，结节中心为无数颗粒状物质，分布在四周的细胞则呈放射状排列（附图13）。

三、讨论
成骨细胞的原代培养是获取组织后的首次培养。

成骨细胞的原代分离培养方法，按成骨细胞分离方法的不同有酶消化法和非酶消化法。

酶消化法就是应用胶原酶、胰酶等胶原溶解酶处理骨组织，借以溶解骨组织中的胶原纤维，放出沉积其中的成骨细胞，制成细胞悬液，进行接种培养，该方法要经过多次酶的消化，操作比较繁琐，作用时间难于控制，对细胞膜表面受体和抗原成分有损害作用，影响细胞功能及实验结果，但可以分离出较大的细胞量［5、6、7］。

非酶消化法主要是植块法，该方法是ecard-charrier于1983年首次应用于分离成骨细胞且获得成功，其原理是组织细胞具有移行生长的特点，该方法是将破碎的骨块植入培养瓶，待细胞长成单层后，再进行传代培养。

方法简单、对细胞损伤少，但获取细胞量较少，难于满足实验要求，特别是需细胞量较大的实验，从而影响实验的均一性，不能客观地说明实验结果。

我们在原代成骨细胞的培养中最早是应用单纯植块法。

在实验过程中我们发现在培养36-48小时时，组织块四周有大量细胞游离出，呈拥挤状态，主要分布在组织块四周，部分细胞因未能贴壁或代谢障碍而死亡。

根据这实验现象，我们将单纯植块法进行改良：在培养36-48小时后，将原培养瓶中的细胞制成悬液，以1：3的比例接种到其他培养瓶，进行培养，可以获得较大量的成骨细胞，克服了单纯植块法获得细胞数量少的特点，满足了实验需要，从而保证实验的均一性。

要获得较纯的成骨细胞关键是植骨块标本的采取，我们在实验中严格剔除了新西兰大白兔的肋骨周围的软组织，包括骨膜，保证了培养细胞的纯度。

在实验中，我们对应用改进后的植块接种技术培养的成骨细胞进行了鉴定。

培养出的细胞呈长梭形、球形、多边形等，符合maric ［8］及maniatopoulous［9］等的描述。

在生物化学和组织化学上，成骨细胞富含碱性磷酸酶，是成骨细胞的早期标志［10］，常用来评估体外细胞的成骨细胞特性［11、12］，碱性磷酸酶染色强度的
差异反映了成骨细胞处于不同分化阶段或处于不同的代谢水平。

分泌骨钙素也是成骨细胞特异性特征［13］，beresfor ［14］等证明体外成骨细胞，具有体外成骨的能力，在含有β一磷酸甘油的培养基中均可形成钙化结节，结节中央为典型的组织内成骨细胞特征呈立方形，四周为矿化基质，外围为放射状排列的成骨细胞。

我们对实验中培养的细胞进行碱性磷酸酶细胞化学染色、骨钙素细胞免疫化学染色。

碱性磷酸酶细胞化学染色显示实验中所培养的细胞具有较高的活性，阳性率达92%以上。

骨钙素免疫组织化学染色显示细胞胞浆内及基质中均是阳性反应。

在条件培养基中也均见钙化结节形成。

以上实验结果证明：改进的植块接种培养技术培养出的是成骨细胞，该方法的优点是增加了培养细胞的数量，克服了单纯植块法细胞量少的缺点。

参考文献
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