酵母菌的培养和形态观察

酵母菌的培养和形态观察
胡雪芳 201300261033
【实验目的】
1.了解酵母培养基的特点以及酵母的培养方法。

2.学习并掌握酵母制片方法，观察酵母的个体形态及死活细胞区分。

3.学习掌握观察酵母的出芽生殖方式。

4.学习掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。

5.学习和掌握酵母的菌落形态特征。

【实验原理】
1.酵母菌
酵母菌形态：是多形的、不运动的单细胞真核微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。

酵母菌繁殖：繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性生殖是通过质配、核配和减数分裂而产生的子囊孢子。

图1. 典型酵母（酿酒酵母）生活史
2.子囊孢子
子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。

在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。

酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。

麦氏培养基有利于酿酒酵母子囊孢子的形成。

3.美蓝染色
本实验通过美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

美蓝为无
毒性染料，其
氧化型为蓝
色，而还原型
为无色。

用它
对酵母菌染
色时，由于活
细胞的新陈
代谢作用，使
细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

1.菌株
表1. 菌株。

2.培养基
表2. 培养基配方
3.实验试剂
表3.实验试剂及其配方。

4.其他
普通光学显微镜、吸水纸、载玻片、酒精灯、接种环等。

1. 麦芽汁培养基的配制
（1） 取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6-12小时，置15℃阴暗
处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。

（2） 将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3-4小
时，糖化程度可用碘滴定之。

（3） 将糖化液用3-4层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄
清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL ，调匀至生泡沫为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。

（4） 将滤液稀释到5-6波美度，pH 约6.4，加入2%琼脂即成。

121℃
灭菌30min 。

2. 酵母菌的一般培养
将酵母菌A 和酵母菌B 分别利用分区划线方法接种到YEPD 培养基上，在28-30℃恒温培养箱中，倒置培养1-2天。

图2. 分区划线法示意图
起点
3.酵母子囊孢子的诱导产生
（1）菌体活化：将菌株分别接种到YEPD平板，28-30℃，倒置培养1-2天。

连续传代2-3次，产生健壮和旺盛的活力细胞。

（2）饥饿处理：取适量活力酵母菌细胞，用手敲击使之在生理盐水中做成均匀细胞悬液。

（3）生孢诱导：取一滴或一接种环菌悬液滴在麦氏琼脂平板上，静置几分钟，使菌液浸入琼脂中，不要旋转或者斡旋平板。

25℃，
培养7天。

4.酵母菌制片与简单染色——美蓝染液水浸片法
（1）取干净载玻片，滴加一滴0.1%吕氏美蓝染液于载玻片中央，无菌操作取YEPD平板上38-30℃培养1-2天的培养物适量，涂抹
于染液中，做成分散的细胞悬液。

（2）用镊子取一盖玻片，将盖玻片一边与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌液上。

（3）将制片放置约3分钟后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根据细胞颜色区分死细胞和活细胞。

（4）染色30分钟后，再次观察，注意死活细胞的比例是否发生变化。

水-碘溶液水浸片步骤与美蓝水浸片制片方法相同。

5.酵母子囊孢子染色——孔雀绿染色法
（1）取干净载玻片，滴加一滴蒸馏水，无菌操作取第3步诱导后培养物适量，涂抹于水中，做成分散的细胞悬液，涂片干燥和加
热固定。

（2）用5%的孔雀绿染色1-2分钟，然后水洗；
（3）用95%的乙醇脱色30秒，水洗；
（4）用0.5%的番红水溶液复染1-2分钟，水洗，滤纸吸水，干燥。

（5）镜检，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，最后用油镜观察。

【实验结果】
1.酵母的培养特征
酵母菌A：米黄色，表面光滑湿润，凸起，边缘光滑近圆形，不
透明，发酵味道浓郁，单菌落大小不一，易挑起。

酵母菌B：米黄色，表面光滑湿润，凸起，边缘光滑近圆形，不
透明，发酵味道浓郁，单菌落大小不一，易挑起。

图3.酵母平板
图左是安琪酵母，图右是贝酵母。

2.酵母细胞形态与出芽生殖
本实验通过美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

0.1% 美蓝水浸片的观察结果如下。

图4. 安琪酵母美蓝染色结果（10*40倍）
图4中是安琪酵母0.1%美蓝染色3min 和染色30min 后细胞存活数量的对比图。

A是美蓝染色3min 后安琪酵母死活细胞的状态，C 是A的局部放大图。

B是美蓝染色30min 后安琪酵母死活细胞的状态，D是B的局部放大图。

通过图4中C和D我们可以看到，与3min 相比，将美蓝染色水浸片放置30min 后，视野中蓝色和淡蓝色的细胞数量明显增加，说明死细胞的比例增加。

图5. 贝酵母美蓝染色结果（10*40倍）
图5中是贝酵母0.1%美蓝染色3min 和染色30min 后细胞存活数量的对比图。

A是美蓝染色3min 后安琪酵母死活细胞的状态，C是A的局部放大图。

B是美蓝染色30min 后安琪酵母死活细胞的状态，D是B的局部放大图。

通过图5中C和D我们可以看到，与3min 相比，将美蓝染色水浸片放置30min 后，视野中蓝色和淡蓝色的细胞数量明显增加，说明死细胞的比例增加。

图6. 酵母美蓝染色结果（10*100倍）
图6中是酵母0.1%美蓝染色结果。

图A是安琪酵母染色结果，图
B是贝酵母染色结果。

通过图6，我们可以观察到安琪酵母细胞为圆形、椭圆形，出芽
生殖。

贝酵母圆形或近圆形，出芽生殖。

3.酵母细胞和子囊孢子
本实验通过孔雀绿来观察生活的子囊孢子。

孔雀绿的观察结果如下。

图7. 酵母孔雀绿染色结果（10*100倍）
图7中是酵母孔雀绿染色结果。

图A是安琪酵母染色结果，图B是贝酵母染色结果。

红色部分是酵母细胞，绿色部分是子囊及子囊孢子。

贝酵母的子囊及子囊孢子数目占总细胞的比例较大。

【分析与讨论】
注意事项：
1.用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免损坏细胞。

2.滴加染液要适当，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会
产生大量气泡。

3.盖玻片要缓慢倾斜覆盖，以免产生气泡。

分析讨论：
1.根据观察，吕氏碱性美蓝染液作用时间与酵母菌死、活细胞比例变
化是否有关系？
有关系，时间越长则视野中死亡酵母菌所占比例就越大。

因为酵母菌处于吕氏碱性美蓝染液中会脱水，导致死亡，时间越长，细胞死亡数量就越多。