磺胺类药物兽药残留检测方法概述.
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2理化法
常用的理化分析方法有薄层色谱法(TLC、高效液相色谱法(HPLC、毛细管电泳法(CE、光谱法以及各种联用技术如气质联用(GC-MS、液质联用LC-MS等。
2.1荧光光度法和TLC法近年来有报道用荧光分光光度法(fluorescence spectropmetry测定磺胺药残留。将磺胺类化合物与邻苯二醛偶合成一种荧光衍生物,其激发波长为365nm,在422~434nm测定其发光强度。本法的优点是灵敏度高,如对磺胺间二甲氧嘧啶的检测限是0.250μg/mL[5]。荧光薄层色谱法是检测组织中磺胺药残留的荧光薄层分析法,美国又将其称为定位磺胺药检测(sulfa-on-sit,SOS。这是美国农业部(USDA和食品安全与检验局(FSIS建立的一种用于筛选猪体液中磺胺二甲嘧啶的薄层色谱分析方法,可以定性或半定量地检测猪的尿、血清及饲料的水提取液或甲醇提取液中磺胺药的残留,检测限达0.4mg/kg。有学者利用TLC方法可筛选出在鲑鱼中的5种磺胺药,即磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺吡啶。将样品提纯净化后,利用乙腈-叔丁基醇-甲醇-氨水(35︰45︰15︰2,V/V作展开剂展开,用荧光胺显色,检测限可达0.136μg/mL[6]。美国农业部食品安全局用荧光胺衍生的薄层色谱(TLC筛选方法检测畜产品中磺胺类药物的残留,这种方法灵敏度高、选择性好,但是TLC方法需要高超的制板技术和点样技术,因而在实践中重现性较差。
1微生物法
微生物检测法的主要原理是根据磺胺药对特异微
生物的抑制作用来定性或定量确定受检样品中磺胺药
Overview on Residue Determination of Sulfa Drug Qi Fengxia
Zhu Yanli
Pei Zhaozhu
Abstract This study was focused on mainly introducing the characteristics and residues harm of sulfa drug.Summerized the testing mothds of the sulfa drug residues detection in animal-derived food ,including microbiological method ,physical and chemical methods ,immunoassay and other methods as well as hyphenated techniques.Keywords Sulfonamides ;
4.2酶联免疫吸附法(ELISA酶联免疫吸附法(ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、可用于大批量样品检测的特点,已成为对磺胺类药物残留大批样本进行定性、定量测定的方法。由于磺胺类药物本身并不具有免疫原性,所以通常将其与载体蛋白进行偶联。Haasnoot[19-20]用合成的母核衍生物TS、PS结合物免疫动物获得了4株单克隆抗体,单抗27G3对18种在< 10.000μg/mL的浓度呈现50%抑制(I50。其中的8种SAs I50<0.1000μg/mL。对于磺胺喹噁啉(SQX,SM2磺胺氯吡嗪(SPZ检出限较高。Nuria pastor N等[21]建立了高特异性ELISA法,可同时测定磺胺噻唑(ST等6种磺胺类药物,检测限1.5~4.5ng/mL,回收率106%。
磺胺类药物兽药残留检测方法概述
戚凤霞
朱燕丽
裴兆柱
(1北京市崇文区动物卫生监督所,
北京
100050
摘要本文主要介绍了磺胺类药物的特点及磺胺类药物残留的危害。概述了目前针对动物源性食品中的磺胺类药物残留检测
的检测方法,包括微生物法、理化法、免疫法等方法以及一些联用技术。关键词
磺胺;
兽药残留;
检测方法
中图分类号S 859.79文献标志码
4免疫法
免疫法主要有放射性免疫法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、胶体金免Βιβλιοθήκη Baidu层析法等。
4.1放射性免疫法(RIA放射性免疫法是最早建立的经典的免疫分析方法,此法样品前处理提取方法简便,可以检测磺胺类总残留量,已经为欧盟和美国FDA认可并且应用于初筛分析[18]。但RIA有缺陷:1放射性核素半衰期短;2反应时间过长(数h~过夜不利于临床应用;3分析的灵敏度是10~7g/mL或10~12g/ mL,再提高有困难,并难以自动化分析,制约了它的发展。
3生物传感器法
生物传感器是以固定化的生物成分(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原或生物体本身(如细胞、微生物、组织等为敏感材料,与适当的化学换能器相结合,用于快速检测物理、化学、生物量的新型器件,与其他方法相比具有精度高,可以做到小型化、自动化、方便现场检测。Gaudin等[16]建立了测定牛奶中SM2残留的生物传感器方法,将SM2与经改良的甲基葡聚糖表面共价连接,其多克隆抗体以不同流速经过,检测限可达17.0ng/g。Haasnoot等[17]建立了单克隆抗体(21C7为基础的检测鸡血浆中8种磺胺类药物的生物传感器免疫方法,血浆稀释10倍的情况下最低检测限7.0~20.0ng/mL。
2.2高效液相色谱法近些年,用HPLC法检测畜产品中磺胺药残留的报道比较多。目前应用最广泛的是HPLC方法。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细(Ф5~10μm,需高压泵推动,柱效高,速度快,灵敏度也可达ng级。检测磺胺药多用反相HPLC,柱子一般采用C8、C18。流动相一般分为乙酸/乙酸胺-乙腈/甲醇、磷酸溶液-乙腈/甲醇、磷酸盐缓冲液-乙腈、乙醇/甲醇-水等几大类,药物的保留能力与流动相的pH值、柱填料等有关。常采用C18柱进行分离。常用的检测器有紫外检测器(UV、二极管阵列检测器(PDA、荧光检测器(FLD、电化学检测器、化学发光检测器等。荧光检测器的选择性强、灵敏度高,样品的净化要求可以降低。Stoev[7]建立了动物源性食品(肉类、肾中的10种常用磺胺类药物的HPLC-FLD检测法,最低检测限可达1.000~5.000μg/kg,在添加1.000、5.000、10.000μg/kg时其回收率分别为64.00%、68.00%、75.00%。Kishid[8]采用PDA-HPLC法检测鸡蛋中SMM、SM2及其N4-乙酰代谢物,在100.0~1000.0ng/mL范围内回收率<91.00%,定量限为20.0~80.0ng/mL。Preechaworapun等[9]采用流动进样体系,用硼掺杂钻石材料电极的安培计检测器的HPLC法检测鸡蛋中SDZ、SMZ、SMM、SDM4种磺胺类药物,回收率为90.00%~107.70%,SDZ、SMZ、SMM最低检测限为0.050μg/g,SDM为0.100~0.050μg/g。Chin-chilla等[10]首次采用HPLC-化学发光检测器来检测牛奶中7种磺胺类药物,最低检测限为5.0ng/mL,样品添加量在5.0、10.0、20.0ng/mL时回收率分别为71.44%~ 94.94%、41.74%~71.87%、5
4.3免疫层析法(金标试纸条胶体金免疫层析试纸条检测速度快,灵敏度高,整个样品分析时间约5~10 min。Verheijen等[22]制得了SM2胶体金快速检测试纸条,此试纸条检测SM2标准液和牛尿样本,检测限10.0ng/ mL,稀释后的新鲜牛奶检测限20.0ng/mL。
5讨论与展望
磺胺类药物残留的以上几种检测方法各有优缺点,微生物法操作简单,适合抗生素总残留的检测,不适合单个药物残留的检测,并且检测限高。
B
作者简介:戚凤霞(1965-,高级兽医师,从事动物卫生监督工作。
收稿日期:
2009-07-05
磺胺类药物(Sulfonamides ,SAs属于化学合成抗菌药,均含有氨苯磺酰胺的基本结构(图1,在医学和多种动物的许多感染性疾病防治中具有重要的地位。磺胺类药物具有抗菌谱广、可以口服或注射、吸收迅速,有的能通过血脑屏障渗入脑脊液、较为稳定、不易变质等优点。但是目前磺胺类抗生素的残留在食品抗生素残留检测中经常发现,因其具有广谱、稳定、经济、易用以及联合抗菌增效剂效果可提高数十倍的特点,农业生产中常以亚治疗浓度的药物做为饲料添加剂来预防疾病的发生,提高饲料的转化率和促进动物生长,其中常用的就有十几种。但不合理的使用很容易造成耐药菌增加,而且动物性食品中残留的药物可能对人们的健康造成潜在的危害,如磺胺二甲嘧啶是动物性食品中主要的残留药物,可诱发癌症[1-2]磺胺类药物在体内乙酰化率高,在体内主要经肝脏代谢为乙酰化磺胺,后者无抗菌活力却保持其毒性作用,在泌尿道析出结晶,损害肾脏。出现结晶尿、血尿、管型尿、尿痛以至尿闭等症状。还可破坏人
veterinary drug residues ;
detection method
图1SAs分子结构图
残留。如四平皿试验方法(four-plate test,FPT、拭子试验(swab test方法、纸片法、Charm检测法等。拭子试验又分为场内拭子试验(swab test of premises,STOP、耐贮存拭子试验(shelf stable swab test,SSST、动物活体拭子试验(live animal swab test,LAST、磺胺拭子试验(sulfonamide swab test,SST等。Barham等[4]首次建立了动物组织中磺胺类药物的微生物检测法,检测限可接近MRL。但是,微生物法常缺乏专一性和精确度,且易受到其他抗生素的干扰,故需要借助免疫法和理化法等进行确定。
理化法检测结果准确,分辨率高,可以做单个药物的残留检测,但是理化设备往往价格昂贵,成本高,并且需要专门的技术人员,不适合现场快速检测。
免疫法目前越来越受到重视,因其检测限低,单个样品检测成本低(如ELISA法,并且适合现场快速检测,尤其是免疫层析法,检测速度快,灵敏度高,样品分析时间短,而且成本低,无需大型仪器,人员要求低,适用于现场检测。
足。Heuer D N等[14]采用MS-LC-MS方法鉴定了鸡蛋中16种磺胺类药物及其残留量,最低定量限为5.0~ 10.0ng,回收率>55.00%。随着样品处理方法的自动化,在线净化方法也应用到质谱分析中,Thompson等[15]建立了检测蜂蜜中7种磺胺类药物的简单快速液质联用技术,回收率为93.30%~101.90%,最低检测限为0.5~2.0 ng/g。此方法采用在线提取净化适合于大量样品的检测。
3.10%~96.79%。
2.3毛细管电泳法与GC、HPLC相比,CE具有分离度高、快速、进样量少和应用有机溶剂少、对样品前处理要求低等优点,广泛应用于各种基质中磺胺类药物残留的检测。Fu M[11]等建立了肉中8种常用磺胺类药物的快速毛细管电泳检测方法,采用35.00mmoL/L Na3PO4-H3PO4(pH6.5缓冲溶液,25kV条件下分离,以1-萘酰乙酸作为内标,回收率为80.00%~97.00%,最低检测限为5.0~10.0ng/g。Lamba等[12]建立了胶束电泳-法检测牛奶中磺胺类药物多残留,用40.00mmoL/L十二烷基硫酸钠(pH7.5为胶束相,在21kV电压、25℃条件下分离,5种磺胺类药物在7min内分离,最低检测限为1.59~7.68nmoL/L,回收率为85.00%~114.00%。2.4色谱质谱联用技术气质联用技术是残留分析中常用的确证方法。Reeves等[13]建立了牛奶中磺胺类药物多残留的气质联用检测方法,样品净化后经甲基-氨基-3-氟代烷衍生化,离子阱检测器检测,可同时检测ST等9种磺胺类药物,最低检测限为10.0ng/mL。GC-MS法不但灵敏度高而且能提供样品的结构信息,但在磺胺类药物检测时需要衍生化去掉分子中的极性基团(如氨基,才能达到满意的效果。HPLC-MS则可以克服此不
的造血系统,造成溶血性贫血症,粒细胞缺乏症,血小板减少症等。有的还可以引起过敏反应,导致耐药菌株产生,导致菌失调等症状[3]。
为了保护人民群众的健康,检测兽药残留的方法越来越多,目前针对动物源性食品中的磺胺类药物残留检测已相继建立了微生物法、理化法、免疫法等方法,并采用了一些联用技术。下面将详细介绍一些这些检测方法。
常用的理化分析方法有薄层色谱法(TLC、高效液相色谱法(HPLC、毛细管电泳法(CE、光谱法以及各种联用技术如气质联用(GC-MS、液质联用LC-MS等。
2.1荧光光度法和TLC法近年来有报道用荧光分光光度法(fluorescence spectropmetry测定磺胺药残留。将磺胺类化合物与邻苯二醛偶合成一种荧光衍生物,其激发波长为365nm,在422~434nm测定其发光强度。本法的优点是灵敏度高,如对磺胺间二甲氧嘧啶的检测限是0.250μg/mL[5]。荧光薄层色谱法是检测组织中磺胺药残留的荧光薄层分析法,美国又将其称为定位磺胺药检测(sulfa-on-sit,SOS。这是美国农业部(USDA和食品安全与检验局(FSIS建立的一种用于筛选猪体液中磺胺二甲嘧啶的薄层色谱分析方法,可以定性或半定量地检测猪的尿、血清及饲料的水提取液或甲醇提取液中磺胺药的残留,检测限达0.4mg/kg。有学者利用TLC方法可筛选出在鲑鱼中的5种磺胺药,即磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺吡啶。将样品提纯净化后,利用乙腈-叔丁基醇-甲醇-氨水(35︰45︰15︰2,V/V作展开剂展开,用荧光胺显色,检测限可达0.136μg/mL[6]。美国农业部食品安全局用荧光胺衍生的薄层色谱(TLC筛选方法检测畜产品中磺胺类药物的残留,这种方法灵敏度高、选择性好,但是TLC方法需要高超的制板技术和点样技术,因而在实践中重现性较差。
1微生物法
微生物检测法的主要原理是根据磺胺药对特异微
生物的抑制作用来定性或定量确定受检样品中磺胺药
Overview on Residue Determination of Sulfa Drug Qi Fengxia
Zhu Yanli
Pei Zhaozhu
Abstract This study was focused on mainly introducing the characteristics and residues harm of sulfa drug.Summerized the testing mothds of the sulfa drug residues detection in animal-derived food ,including microbiological method ,physical and chemical methods ,immunoassay and other methods as well as hyphenated techniques.Keywords Sulfonamides ;
4.2酶联免疫吸附法(ELISA酶联免疫吸附法(ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速、可用于大批量样品检测的特点,已成为对磺胺类药物残留大批样本进行定性、定量测定的方法。由于磺胺类药物本身并不具有免疫原性,所以通常将其与载体蛋白进行偶联。Haasnoot[19-20]用合成的母核衍生物TS、PS结合物免疫动物获得了4株单克隆抗体,单抗27G3对18种在< 10.000μg/mL的浓度呈现50%抑制(I50。其中的8种SAs I50<0.1000μg/mL。对于磺胺喹噁啉(SQX,SM2磺胺氯吡嗪(SPZ检出限较高。Nuria pastor N等[21]建立了高特异性ELISA法,可同时测定磺胺噻唑(ST等6种磺胺类药物,检测限1.5~4.5ng/mL,回收率106%。
磺胺类药物兽药残留检测方法概述
戚凤霞
朱燕丽
裴兆柱
(1北京市崇文区动物卫生监督所,
北京
100050
摘要本文主要介绍了磺胺类药物的特点及磺胺类药物残留的危害。概述了目前针对动物源性食品中的磺胺类药物残留检测
的检测方法,包括微生物法、理化法、免疫法等方法以及一些联用技术。关键词
磺胺;
兽药残留;
检测方法
中图分类号S 859.79文献标志码
4免疫法
免疫法主要有放射性免疫法、酶联免疫吸附法、生物传感器法、胶体金免Βιβλιοθήκη Baidu层析法等。
4.1放射性免疫法(RIA放射性免疫法是最早建立的经典的免疫分析方法,此法样品前处理提取方法简便,可以检测磺胺类总残留量,已经为欧盟和美国FDA认可并且应用于初筛分析[18]。但RIA有缺陷:1放射性核素半衰期短;2反应时间过长(数h~过夜不利于临床应用;3分析的灵敏度是10~7g/mL或10~12g/ mL,再提高有困难,并难以自动化分析,制约了它的发展。
3生物传感器法
生物传感器是以固定化的生物成分(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原或生物体本身(如细胞、微生物、组织等为敏感材料,与适当的化学换能器相结合,用于快速检测物理、化学、生物量的新型器件,与其他方法相比具有精度高,可以做到小型化、自动化、方便现场检测。Gaudin等[16]建立了测定牛奶中SM2残留的生物传感器方法,将SM2与经改良的甲基葡聚糖表面共价连接,其多克隆抗体以不同流速经过,检测限可达17.0ng/g。Haasnoot等[17]建立了单克隆抗体(21C7为基础的检测鸡血浆中8种磺胺类药物的生物传感器免疫方法,血浆稀释10倍的情况下最低检测限7.0~20.0ng/mL。
2.2高效液相色谱法近些年,用HPLC法检测畜产品中磺胺药残留的报道比较多。目前应用最广泛的是HPLC方法。HPLC的分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细(Ф5~10μm,需高压泵推动,柱效高,速度快,灵敏度也可达ng级。检测磺胺药多用反相HPLC,柱子一般采用C8、C18。流动相一般分为乙酸/乙酸胺-乙腈/甲醇、磷酸溶液-乙腈/甲醇、磷酸盐缓冲液-乙腈、乙醇/甲醇-水等几大类,药物的保留能力与流动相的pH值、柱填料等有关。常采用C18柱进行分离。常用的检测器有紫外检测器(UV、二极管阵列检测器(PDA、荧光检测器(FLD、电化学检测器、化学发光检测器等。荧光检测器的选择性强、灵敏度高,样品的净化要求可以降低。Stoev[7]建立了动物源性食品(肉类、肾中的10种常用磺胺类药物的HPLC-FLD检测法,最低检测限可达1.000~5.000μg/kg,在添加1.000、5.000、10.000μg/kg时其回收率分别为64.00%、68.00%、75.00%。Kishid[8]采用PDA-HPLC法检测鸡蛋中SMM、SM2及其N4-乙酰代谢物,在100.0~1000.0ng/mL范围内回收率<91.00%,定量限为20.0~80.0ng/mL。Preechaworapun等[9]采用流动进样体系,用硼掺杂钻石材料电极的安培计检测器的HPLC法检测鸡蛋中SDZ、SMZ、SMM、SDM4种磺胺类药物,回收率为90.00%~107.70%,SDZ、SMZ、SMM最低检测限为0.050μg/g,SDM为0.100~0.050μg/g。Chin-chilla等[10]首次采用HPLC-化学发光检测器来检测牛奶中7种磺胺类药物,最低检测限为5.0ng/mL,样品添加量在5.0、10.0、20.0ng/mL时回收率分别为71.44%~ 94.94%、41.74%~71.87%、5
4.3免疫层析法(金标试纸条胶体金免疫层析试纸条检测速度快,灵敏度高,整个样品分析时间约5~10 min。Verheijen等[22]制得了SM2胶体金快速检测试纸条,此试纸条检测SM2标准液和牛尿样本,检测限10.0ng/ mL,稀释后的新鲜牛奶检测限20.0ng/mL。
5讨论与展望
磺胺类药物残留的以上几种检测方法各有优缺点,微生物法操作简单,适合抗生素总残留的检测,不适合单个药物残留的检测,并且检测限高。
B
作者简介:戚凤霞(1965-,高级兽医师,从事动物卫生监督工作。
收稿日期:
2009-07-05
磺胺类药物(Sulfonamides ,SAs属于化学合成抗菌药,均含有氨苯磺酰胺的基本结构(图1,在医学和多种动物的许多感染性疾病防治中具有重要的地位。磺胺类药物具有抗菌谱广、可以口服或注射、吸收迅速,有的能通过血脑屏障渗入脑脊液、较为稳定、不易变质等优点。但是目前磺胺类抗生素的残留在食品抗生素残留检测中经常发现,因其具有广谱、稳定、经济、易用以及联合抗菌增效剂效果可提高数十倍的特点,农业生产中常以亚治疗浓度的药物做为饲料添加剂来预防疾病的发生,提高饲料的转化率和促进动物生长,其中常用的就有十几种。但不合理的使用很容易造成耐药菌增加,而且动物性食品中残留的药物可能对人们的健康造成潜在的危害,如磺胺二甲嘧啶是动物性食品中主要的残留药物,可诱发癌症[1-2]磺胺类药物在体内乙酰化率高,在体内主要经肝脏代谢为乙酰化磺胺,后者无抗菌活力却保持其毒性作用,在泌尿道析出结晶,损害肾脏。出现结晶尿、血尿、管型尿、尿痛以至尿闭等症状。还可破坏人
veterinary drug residues ;
detection method
图1SAs分子结构图
残留。如四平皿试验方法(four-plate test,FPT、拭子试验(swab test方法、纸片法、Charm检测法等。拭子试验又分为场内拭子试验(swab test of premises,STOP、耐贮存拭子试验(shelf stable swab test,SSST、动物活体拭子试验(live animal swab test,LAST、磺胺拭子试验(sulfonamide swab test,SST等。Barham等[4]首次建立了动物组织中磺胺类药物的微生物检测法,检测限可接近MRL。但是,微生物法常缺乏专一性和精确度,且易受到其他抗生素的干扰,故需要借助免疫法和理化法等进行确定。
理化法检测结果准确,分辨率高,可以做单个药物的残留检测,但是理化设备往往价格昂贵,成本高,并且需要专门的技术人员,不适合现场快速检测。
免疫法目前越来越受到重视,因其检测限低,单个样品检测成本低(如ELISA法,并且适合现场快速检测,尤其是免疫层析法,检测速度快,灵敏度高,样品分析时间短,而且成本低,无需大型仪器,人员要求低,适用于现场检测。
足。Heuer D N等[14]采用MS-LC-MS方法鉴定了鸡蛋中16种磺胺类药物及其残留量,最低定量限为5.0~ 10.0ng,回收率>55.00%。随着样品处理方法的自动化,在线净化方法也应用到质谱分析中,Thompson等[15]建立了检测蜂蜜中7种磺胺类药物的简单快速液质联用技术,回收率为93.30%~101.90%,最低检测限为0.5~2.0 ng/g。此方法采用在线提取净化适合于大量样品的检测。
3.10%~96.79%。
2.3毛细管电泳法与GC、HPLC相比,CE具有分离度高、快速、进样量少和应用有机溶剂少、对样品前处理要求低等优点,广泛应用于各种基质中磺胺类药物残留的检测。Fu M[11]等建立了肉中8种常用磺胺类药物的快速毛细管电泳检测方法,采用35.00mmoL/L Na3PO4-H3PO4(pH6.5缓冲溶液,25kV条件下分离,以1-萘酰乙酸作为内标,回收率为80.00%~97.00%,最低检测限为5.0~10.0ng/g。Lamba等[12]建立了胶束电泳-法检测牛奶中磺胺类药物多残留,用40.00mmoL/L十二烷基硫酸钠(pH7.5为胶束相,在21kV电压、25℃条件下分离,5种磺胺类药物在7min内分离,最低检测限为1.59~7.68nmoL/L,回收率为85.00%~114.00%。2.4色谱质谱联用技术气质联用技术是残留分析中常用的确证方法。Reeves等[13]建立了牛奶中磺胺类药物多残留的气质联用检测方法,样品净化后经甲基-氨基-3-氟代烷衍生化,离子阱检测器检测,可同时检测ST等9种磺胺类药物,最低检测限为10.0ng/mL。GC-MS法不但灵敏度高而且能提供样品的结构信息,但在磺胺类药物检测时需要衍生化去掉分子中的极性基团(如氨基,才能达到满意的效果。HPLC-MS则可以克服此不
的造血系统,造成溶血性贫血症,粒细胞缺乏症,血小板减少症等。有的还可以引起过敏反应,导致耐药菌株产生,导致菌失调等症状[3]。
为了保护人民群众的健康,检测兽药残留的方法越来越多,目前针对动物源性食品中的磺胺类药物残留检测已相继建立了微生物法、理化法、免疫法等方法,并采用了一些联用技术。下面将详细介绍一些这些检测方法。