实验二细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察报告 (1)

实验二细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察

一、实验目的

1、了解细胞糖被的特点和功能，了解植物凝集素的作用

2、了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度

二、实验原理

1、细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

2、细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。

本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。

由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。

三、实验材料、器具和试剂

1、器材与仪器：显微镜、载玻片、盖玻片、直管、5ml量筒、滴管、天平、离心管

2、材料与试剂：土豆块茎，鸡（采血）、5mmol/LNaCl、65 mmol/LNaCl、0.15 mol/LNaCl、0.8 mol/L甲醇、0.8 mol/L丙三醇、2% Triton X-100、氯仿、PBS缓冲液、生理盐水

四、实验步骤

（一）细胞凝集反应

1、2%鸡血红细胞悬液制备：以无菌方法抽取鸡静脉血液（加抗凝剂），用生理盐水洗5次，每次2000rpm离心5 min，最后按沉淀压积的红细胞体积，用生理盐水配成2％红细胞悬液待用。

2、土豆凝集素制备：称取土豆去皮块茎2g → 加10 mL PBS缓冲液，浸泡2h

3、细胞凝集反应：土豆凝集素１滴、2%鸡血红细胞液１滴，载玻片上混匀，静置20min （动作轻柔，不要将红细胞弄破）

4、对照：PBS１滴、2%鸡血红细胞液１滴

5、观察：肉眼观察，同时用显微镜观察，比较两者的不同

（二）细胞膜的通透性观察

1、制备血细胞悬液：取50ml烧杯将鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中按1:10稀释（肝素钠0.2mg/ml,一般范围在0.01-0.2 mg/ml，等渗液为0.15 mol/LNaCl），可见该悬液为一种不透明的红色液体。

2、观察溶血现象：取一支试管加入5ml蒸馏水，加入1ml鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。

3、观察鸡红细胞对不同物质的通透性

（1）取一支试管，加入5 mmol/LNaCl溶液5ml和1ml鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间。

（2）按上述方法分别加入下列6种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。

① 65 mmol/L NaCl

② 0.15 mol/L NaCl

③ 0.8 mol/L甲醇

④ 0.8 mol/L丙三醇

⑤氯仿

⑥2% Triton X-100

可制备临时装片镜下观察溶血现象，若发生溶血可在镜下看到破碎的红细胞。

五、实验预期结果与作业

细胞凝集反应实验预期结果：PBS对照组的红细胞逐渐向中间靠拢，最终形成中间颜色较深，边缘颜色较浅的红细胞浑浊溶液（溶胶）；土豆凝集素实验组溶液中的红细胞渐渐凝集成颗粒状，逐渐聚拢，最后在液滴中形成一大块血红色的血块。

六、讨论

1、影响细胞凝集的因素有哪些？

答：溶血剂的影响、检测试剂对结果造成影响、血样采集制作过程中的影响、凝集素的浓度、血细胞浓度、在一定浓度范围内，影响细胞凝集的时间以及程度等等。

2、细胞膜通透性观察实验过程中所需注意？

1、不容易识别溶血现象时，对比观察，首先进行等渗和低渗液的实验，可背后放一张白纸辅助观察，也可找一张带字的纸进行观察，透过试管看字是否逐渐清晰，如果清晰，则发生溶血现象；

2、加入试剂后，不能强力摇晃试管，以免造成人为红细胞破裂，影响判断；

因相对分子质量大小对膜通透性有影响，所以将溶血时间适当的延长至15min，若15min 后还不溶，则判断为不溶血；

3、注意同组实验过程的同步性，尤其是加入血液的操作要迅速，实验中判断结果的同学须是同一个人，避免人主观因素造成影响；

3、按照凝集素的亚基特征可分为几类？

部分凝集,只含1个糖结合结构域,它们不能沉积复合糖和凝集细胞;

全凝集,含至少2个相同或非常相似的糖结合结构域,它们可以凝集细胞和沉淀复合糖,绝大多数具凝集功能的植物凝集素属于此类;

嵌合凝集素，是一类融合蛋白,由1个或多个糖结合结构域及1个具有酶活性或其他生物活性的结构域共同组成;

超凝集素,至少含2个以上不同的糖结合结构域。