免疫佐剂及其应用

配制时注意事项：
①氢氧化铝具有较强的吸附力，所以，制胶过 程中一般用软化水或去离子水洗涤。 ②氢氧化铝胶为两性化合物，过酸或过碱都会 失去胶态。故要掌握好化合时的pH值。 ③贮存铝胶应放在耐酸搪瓷缸或耐酸池中，并 严密封盖，贮放期不超过3个月。 ④铝胶室温保存，以免破坏胶态。
2．明矾（Alum）
制成什么样的乳剂型，与乳化剂及乳化 方法密切相关。 通常W/O型乳剂较粘稠，在机体内不易 分散，佐剂活性较好，为生物制品所采 用的主要剂型； O/W型乳剂较稀薄，注入机体后易于分 散，但其佐剂活性很低，生物制品一般 不采用这种剂型。
2．乳化剂
（1）乳化剂的种类 天然乳化剂：来自动植物，如阿拉伯胶、 海藻酸钠、蛋黄以及炼乳等。 人工合成乳化剂，再分为离子型和非离 子型。
（一）颗粒性佐剂
1．盐类佐剂：包括氢氧化铝胶、各种明矾、 磷酸铝等。 2．油水乳剂佐剂 ：如弗氏完全佐剂 （Freund’s complete adjuvant, FCA）、弗氏 不完全佐剂（Freund’s incomplete adjuvant, FIA）和矿物油白油佐剂。 3．免疫刺激复合物（ISCOM）佐剂。
4、作用机理
①抗原递呈（antigen presentation） 指抗原分子递呈给T细胞的方法。 抗原递呈的方法对免疫应答的实质和强 度有重要影响。佐剂与疫苗的联合使用， 有助于抗原性物质在胞内被加工，被 MHC分子特异性的结合、保护、运输并 递呈给效应细胞。
②抗原寻的（antigen targeting）
（二）油乳佐剂
指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形 成的佐剂，如弗氏佐剂。 该类佐剂主要在抗原寻的过程中起作用，使抗 原在注射部位保持稳定，为抗原在淋巴系统中 转运提供载体，增加单核细胞的形成和积聚。 油乳剂疫苗的免疫效力高低，直接与乳化作用 的好坏和乳剂成分的质量等有关。 一种好的乳剂疫苗应是油包水（水/油或W/O） 或水包油（油/水或O/W）型，粘度低，颗粒均 匀，稳定性良好，呈乳白色。
二、佐剂分类
按佐剂物理性质，分为颗粒型佐剂和非颗粒型 佐剂； 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法），可 分为微生物及其组分与非微生物物质； 按佐剂在体内存留的时间，则可分为贮存型佐 剂（depot type adjuvant）和非贮存型（nondepot type adjuvant）。 颗粒型佐剂多半属于贮存型的，非颗粒型佐剂 大多属于非贮存型佐剂。
新型佐剂研究及其应用概况
一、概论
凡是可以增强抗原特异性免答的物质均 称为佐剂。
1、佐剂的定义 、
(adjuvant）一词来源于拉丁语，原为辅 助之意。在免疫学和生物制品学上又称 为免疫佐剂（immunologic adjuvant）。 传统的概念为：当一种物质先于抗原或 与抗原混合或同时注射于动物体内，能 非特异性地改变或增强机体对该抗原的 特异性免疫应答，发挥其辅佐作用者， 都称之为佐剂。
1．乳剂的概念
“乳剂”是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒， 混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。 被分散的物质称为分散相（内相），承受分散 相的液体称连续相（外相），两相间的界面活 性物质称为乳化剂。 当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相 时，制成的乳剂为W/O型，反之为O/W型。
W/O型、O/W型乳剂比较
（2）剂在油中法：
此法将乳化剂溶于油相，将油相直接加 入水相中得O/W，如水相直接加入油相， 得到W/O型，如欲得O/W，继续加入至 变型。该法制成的乳剂，一般均匀颗粒 直径在0.5µm左右，比较稳定。
非颗粒性佐剂
7．脂质分子类佐剂（lipid molecules）： 如脂多糖及其衍生物 （lipopolysaccharide derivatives），一 些脂溶性维生素（fat-soluble vitamins） 如维生素A和维生素E等。 8．其他：包括一些蛋白毒素如霍乱毒素 （CT）、百日咳毒素（PT）和破伤风类 毒素（TT）等；脂磷壁酸（LTA）；维 生素B12等。
非颗粒性佐剂
4．含硫复合物类佐剂（suiphur-containing compounds）：如左旋咪唑（levamisole）。 5．碳水化合物高分子类佐剂（carbohydrate polymers）：如香菇多糖（lentinan）、硫酸 多糖（sulfated polysaccharides）等其他一些 多糖和DEAE-葡聚糖等。 6．细胞因子类佐剂（cytokine）：如白介素-1 （IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4） 和γ-干扰素（γ-IFN）等。
4．乳剂配方与乳化方法
使用不同乳化剂和不同的配合比例及乳化方法， 决定了制备乳剂的性状和稳定性。疫苗生产中 主要有两种基本方法。 （1）剂在水中法：此法将乳化剂直接溶于水 中，在激烈搅拌下将油加入，可直接生成O/W 乳剂。若欲得W/O型，可继续加入油，直到发 生变型。该法通常用匀浆器或胶体磨，高速搅 拌而得到较好的乳剂。
常规佐剂和新型免疫佐剂
目前，铝盐类佐剂、油水乳剂佐剂和蜂 胶佐剂等比较常用，属于常规佐剂。 细胞因子类佐剂、 CpG DNA、基因工程 减毒素、免疫刺激复合物佐剂、脂质体 佐剂及MF59佐剂等是目前研究的热点， 其中有些也已经开始用于生产实际，属 于新型免疫佐剂。
三、常规免疫佐剂
（一）铝盐类佐剂 该类佐剂在生物制品上应用广泛，对体 液免疫作用很明显，与抗原混合注射时， 可通过抗原寻的过程显著增高抗体滴度。 可溶性抗原与此类佐剂混合后成为凝胶 状态，可建立一个短时的贮存颗粒，将 可溶性抗原转化为一种便于吞噬的形式， 以利于巨噬细胞吸附。
颗粒性佐剂
4．蜂胶佐剂（propolis）。 5．脂质体佐剂（liposomes）。 6．其他：MF59佐剂、微囊化佐剂 6 MF59 （microencapsulation）、硬脂酰酪 氨酸佐剂（slearyltyrosine）和γ－菊 粉（gamma-inulin）等。
（二）非颗粒性佐剂
1．肽类佐剂（peptides）：如胞壁酰二肽 （MDP）及其衍生物、去胞壁酰多肽 （desmuramyl peptides）、脂肽 （lipopeptides）和免疫调节多肽 （immunomodulatory peptides）等。 2．表面活性分子类佐剂（surface-active molecules）：如非离子阻断共聚物表面活性剂 （nonionic block copolymers）和海藻糖合成 衍生物（TDM）等。
离子型乳化剂
阴离子型：如碱肥皂、月桂酸钠、十二 烷基磺酸钠和硬脂酸铝等，多用于乳化 一般生物制剂； 阳离子型：阳离子类乳化剂有氯化苯甲 烃铵、溴化十六烷三甲基和氯化十六烷 铵代吡啶等，多元醇或聚合多元醇的脂肪酸脂类或醚 类物质，如月桂酸聚甘油脂、山梨醇脂和单油 酸脂等。它们具有一定的亲水性和亲油性基团， 为制造医药或化妆品的乳化剂。制备注射用油 乳剂灭活疫苗，最适用的乳化剂有 去水山梨醇单油酸酯（其中，司本-80和 Arlacel-A是同类产品）、 聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯（商品名吐温80）和硬脂酸铝等。
指抗原传递给免疫系统中适当效应细胞 的效率。佐剂对于抗原寻的涉及到的一 系列机制，包括吸引巨噬细胞到达组织 部位、活化吞噬细胞、促进抗原与细胞 受体的结合等有重要作用。
③免疫调节（immune modulation）
是指任何可以修饰的免疫效应细胞对抗 原或表位进行加工的机制。通过这种机 制，可以改变特异性免疫应答的本质或 强度。 T细胞有Th1和Th2两个亚类。同一抗原 和不同佐剂一起使用能够引起不同的免 疫反应。因此，通过筛选特定的佐剂， 可以达到诱导正确的免疫应答的目的。
3．白油佐剂
制苗用的白油应无多环芳烃化合物、粘度低、 无色、无味和无毒性。Drakocel-6VR、Marcol52和Lipolul-4是国内外常用的制苗用白油。 我国目前选用杭州炼油厂的7号或10号白油和 北京石油化工科学研究院的合成白油，其质量 标准为：无色无味，50℃运动粘度7m2／s左右， 紫外吸收值（250～350nm）＜0.1％，紫外消 光系数＜12×108；单环芳烃与双环芳烃含量 低于0.5％，无多环芳烃； 小鼠腹腔注射0.5ml或家免皮下注射2.0ml白油， 观察60d，表现正常。
非颗粒性佐剂
3．核酸及其衍生物类佐剂（nucleic acid derivatives）：如合成核苷酸聚 合体（synthetic olynucleotides）、 次黄嘌呤衍生物（hypoxanthine derivatives）和免疫刺激序列DNA （CpG DNA或CpG 寡聚脱氧核苷酸 （CpG-ODN））等。
（2）乳化剂的选择
通常可根据用途，依据乳化剂的HLB值（亲水 亲油平衡值）进行选择。乳化剂的HLB值与其 在水中的溶解度相关； 亲油性的在水中溶解度小，HLB值低，易形成 油包水型油乳剂。HLB值为4～6的乳化剂适用 于制造W/O型油乳剂；常用的司本-80，HLB值 为4.3，在水中溶解度低，不易在水中分散， 溶于多种有机溶剂，性质稳定，易形成W/O型 油乳剂； 亲水性强的在水中溶解度大，HLB值高，容易 形成水包油型油乳剂； HLB值在8～18的乳化 剂适用于O/W型油乳剂。吐温-80，其HLB值为 15.0，易溶于水，易形成O/W型油乳剂。
1．氢氧化铝胶
又称铝胶，其佐剂活性与质量密切相关， 质优的铝胶分子细腻、胶体性良好、稳 定，吸附力强，保存两年后其吸附力不 变。铝胶可用于制造多种兽用疫苗。各 厂家采用不同的合成方法制备铝胶，优 点各异。
制法
（1）用铝粉加烧碱合成法：用量按下列反应式计算： 2Al(OH)3+12H2O+3H2SO4→Al2(SO4)3·18H2O A12(SO4)3·18H2O+6NaOH→2Al(OH)3+2Na2SO4+18 H2O （2）用明矾加碳酸钠合成法：用量按下列反应式计算： 2 2 KAl(SO4)2+3Na2CO3+3H2O→2Al(OH)3+3Na2SO4+ 3CO2↑。 （3）用三氯化铝与氢氧化钠合成： A1C13+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl。此法合成的铝胶 含量低，透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物制 品，认为佐剂效果良好，注射部位无硬结反应。
有钾明矾（KAl（SO4）2·12H2O）和铵明矾（AlNH2 （SO4）2·12H2O）两种。 作为佐剂用于生物制品的主要是钾明矾（即硫酸铝 钾）。 制造时，先将灭活菌液调至pH 8.0土0.1，选精制明矾 制成10％溶液，高压灭菌后，冷至25℃以下备用。按 菌液量加入明矾溶液1～2％，充分振荡，然后沉淀。 佐剂作用与氢氧化铝胶近似，但该法较简便，应用较 广，如破伤风明矾沉淀类毒素和气肿疽明矾灭活疫苗 等。 在美国只有明矾可在人体中应用。
3．磷酸三钙
在疫苗中加入氯化钙和磷酸氢二钠，使 在疫苗中化合成磷酸三钙，吸附抗原后 沉淀，所制出的几种疫苗免疫效果良好。 此法简便，质量稳定。 铝盐类佐剂成本低廉，使用方便，安全 性较好，已被广泛用于兽用疫苗，乙肝、 白喉等重组疫苗的佐剂。
缺点：
①轻度局部反应，可形成肉芽肿，个别形成局 部无菌性脓肿； ②铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶易变性； ③有可能对人、畜神经系统有影响； ④主要激活Th2免疫细胞，诱导体液免疫应答。 而诱导细胞介导的免疫应答作用不明显。只适 用于以抗体为主要保护性免疫的疾病的疫苗， 如白喉、破伤风、乙肝、麻疹等。
2、作用特点
①能明显增强多糖或多肽等抗原性微弱 的物质诱导机体产生特异性免疫应答； ②用最少量的抗原和最少的接种次数刺 激机体可产生足够的免疫应答和高滴度 的抗体，在血流或粘膜表面能维持较长 的时间，发挥持久的效果。
3、佐剂的作用
①改变正常免疫机能，吸引大量巨噬细 胞以吞噬抗原； ②改变抗原的构型，使抗原物质降解并 加强其免疫原性； ③延长抗原在组织内的贮存时间，使抗 原缓慢降解和缓释，并发挥免疫系统的 细胞间协同作用（巨噬细胞与T细胞，T 细胞与B细胞）。