孚尔根

课程名称：细胞生物学指导老师：成绩：__________________

实验名称：孚尔根染色同组学生姓名：

一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填）

三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填）

五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理

七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得

一、实验目的

1.以Feulgen染色法为例学习细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法；

2.观察DNA在细胞内的分布。

二、实验原理

孚尔根反应分为水解和显色两个步骤。

在水解过程中，细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后，DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的连接打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff氏试剂作用，形成紫红色的三苯甲烷衍生物。

Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。但是，细胞中除了DNA酸解会产生醛基之外，多糖等物质也会产生醛基，此外细胞中可能还有自由醛基，但多糖的醛基不会再该反应条件下裸露，而且自由醛基可被盐酸消除；此外，细胞中的RNA也不被染色。目前认为，RNA的N-糖苷键较为稳定，在孚尔根反应的酸解条件下，其嘌呤碱基不会易被脱去。故只有DNA不完全水解出来的醛基才能与Schiff试剂反应生成紫红色产物；由于线粒体，叶绿体的结构原因，内部的DNA也不被染色。从而，孚尔根反应时对细胞中核DNA高度专一的一种检测手段。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

三、实验材料与试剂

器材：显微镜、盖玻片、染色缸、眼科剪、解剖刀、镊子、水浴锅

试剂：Schiff试剂，亚硫酸水溶液，1mol/L HCl，5%三氯醋酸

材料：洋葱鳞茎

四、实验步骤

1.撕取小块洋葱内表皮，放入10mL预热的60°C的1mol/L HCl中温育水解8-10分钟。

2.自来水漂洗表皮5min。

3.Schiff试剂避光浸染5分钟。

4.用新鲜配制的亚硫酸水10mL漂洗2次，每次1min

5.自来水漂洗5分钟。

6.将表皮平铺于载玻片上，加盖玻璃片，在显微镜下观察。

对照试验：

方法1：标本不经过水解直接放入Schiff试剂中染色。

方法2：标本在HCl水解前用5%三氯醋酸90摄氏度处理15min，破坏材料中DNA，其余步骤相同。

六、实验结果与分析

七、讨论、心得

7.1讨论

1.从实验因此凡有DNA的地方，都能显示紫红色。但是，细胞中除了DNA酸解会产生醛基之外，多糖等物质也会产生醛基，此外细胞中可能还有自由醛基，但多糖的醛基不会再该反应条件下裸露，而且自由醛基可被盐酸消除；此外，细胞中的RNA也不被染色。目前认为，RNA的N-糖苷键较为稳定，在孚尔根反应的酸解条件下，其嘌呤碱基不会易被脱去。故只有DNA不完全水解出来的醛基才能与Schiff 试剂反应生成紫红色产物；由于线粒体，叶绿体的结构原因，内部的DNA也不被染色。从而，孚尔根反应时对细胞中核DNA高度专一的一种检测手段。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。

2.实验可能出现的问题：

2.1在弱酸水解步骤中，在实验材料放入1mol/L HCl中温育水解8-10分钟，但是如果水解的时间

不够或过长，都能导致最后显微镜下的细胞核染色不明显。时间不够时，分子中嘌呤和脱氧核糖之间的糖苷键没有被大部分被切断，导致脱氧核糖释放出游离的醛基较少，染色不明显。而如果时间过长，则会导致DNA分子被彻底水解，游离出的醛基和细胞中其他自由醛基一样，与Schiff试剂的结合会被亚硫酸在后面消除，因此染色程度低。

2.2 没有被盐酸处理过的材料，在经过染色后，也呈现了红色的细胞核，但是颜色偏低。理论上来

说，此处的细胞核是不应被染上色的，因为孚尔根反应的专一性；但是，可能是Schiff避光染色的时间过久，也能使细胞核染上少许红色。

2.3有些实验装片在用在亚硫酸水溶液处理后，细胞质仍呈现较浅的红色；原因可能是亚硫酸水溶

液处理的时间较短，没有完全屏蔽自由醛基的影响。因此，可以通过延长处理时间来得到较清晰的装片。

7.2 心得

从本实验中，我了解了用细胞化学方法检测细胞核DNA的原理和方法，同时也理解了如何排除实验中出现的各种问题。

八、实验作业

简述Feulgen反应的原理及关键步骤

答：

原理：细胞中DNA经1N60℃盐酸水解后，DNA双螺旋结构中的嘌呤与脱氧核糖之间的连接打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基；Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液；当无色品红与醛基结合形成紫红色的三苯甲烷衍生物。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色基团，所以具有颜色。

关键步骤：

1.放入10mL预热的60°C的1mol/L HCl中温育水解8-10分钟

——这个操作能使DNA水解，使分子中嘌呤和脱氧核糖之间的糖苷键被切断，脱氧核糖释放出游离的醛基。

2.Schiff试剂避光浸染5分钟。

——该步骤能使Schiff碱同细胞中的游离醛基结合

3.用新鲜配制的亚硫酸水10mL漂洗2次，每次1min。

——该步骤中，SO2能使品红和醛基结合的反应平衡向逆方向移动，因此能消除/屏蔽细胞中自由醛基和Schiff试剂结合带来影响。