多酚氧化酶的测定方法

茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定解析

实验一茶鲜叶多酚氧化酶的活性测定（3学时）一、目的要求1、通过实验，掌握茶叶多酚氧化酶活性的测定方法。

2、理解酶活性测定常规方法及一般原理。

二、基本原理茶叶多酚氧化酶是茶树体内最重要的酶类之一，它不仅在茶树生理代谢过程中起着重要作用，而且在茶叶加工，尤其在红茶制造过程中，催化多酚类物质的氧化也起着主导作用。

多酚氧化酶的活性检测方法，包括检压法、分光光度法、氧电极法和滴定法等。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH 条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在460nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。

反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2 02 --------------------- > 邻醌 + H20三、仪器及试剂1、材料：茶树鲜叶。

2、仪器：72 1 型分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3、试剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）; 0.1M磷酸缓冲液（pH6.5）;硫酸铵；1% 邻苯二酚溶液；0.1%脯氨酸溶液；6M 尿素溶液或20%三氯醋酸。

四、操作步骤1、粗酶液的制备：称取洗尽茶树鲜叶5.0g于研钵（或匀浆机）中，加入2g不溶性聚乙烯吡咯烷酮（事先用蒸馏水浸洗，然后过滤以除去杂质）和100ml 0.1M pH6.5 磷酸缓冲液,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除沉淀，上清液再加硫酸铵使达60％饱和度，离心收集沉淀。

将所得沉淀溶于2~3ml 0.1M pH6.5磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2、活性酶的测定：取酶液1ml于离心管中，加入3ml反应混合液（2.0ml 0.1M pH6.5 磷酸缓冲液，0.6ml 1%邻苯二酚溶液；0.4ml 0.1%脯氨酸溶液），在37C恒温水浴中保温10min,立即加入6M尿素溶液3ml或20%三氯醋酸1ml终止反应。

多酚氧化酶活性的测定-紫外分光光度法

多酚氧化酶活性的测定-紫外分光光度法1 范围本非标方法规定了番茄酱、土豆、香蕉等易褐变食品中多酚氧化酶紫外测定方法。

本非标方法适用于番茄酱、土豆、香蕉等易褐变食品中多酚氧化酶活性的测定。

2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。

凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。

用紫外分光光度法在408nm波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力，反应式如下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2→邻醌＋ H2O4 试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯。

水为 GB/T 6682 规定的二级水或去离子水。

4.1 磷酸盐缓冲液[PH7.0]：0.2mol/LNaH2PO4：0.2mol/LNa2HPO4=39：61；0.2mol/L的NaH2PO4：准确称取NaH2PO4·2H2O 3.12g加重蒸水至100ml溶解；0.2mol/L的 Na2HPO4：准确称取Na2HPO4·12H2O 7.16g加重蒸水至100ml溶解。

4.2 邻苯二酚溶液[c=0.04mol/L]:准确称取0.44g邻苯二酚加重蒸水至100ml溶解。

5 仪器5.1 紫外分光光度计。

5.2 高速冷冻离心机，50ml离心管。

5.3 分析天平：感量0.0001g。

5.4 超声波清洗仪（可调温）。

6 试样的制备和保存6.1 试样的制备：ppo粗酶提取液番茄酱：取适量样品搅拌均匀，称取2g样品放入离心管里，加入10mL（固液比为20%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。

土豆：新鲜土豆先用自来水、再用蒸馏水洗净，擦干，削去1cm厚果皮后，切块，放入打浆机中打成匀浆状，称取5g样品放入离心管中，加入8.23mL（固液比为60.6%）磷酸盐缓冲液（pH7.0），涡旋直至固液混合均匀。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020实验四、马铃薯块茎多酚氧化酶（PPO）活性测定及酶学性质一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等．是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶．普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成醌，使组织形成褐变．以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2O2——————→邻醌＋H2O三、试验材料、试剂及试验用品1．材料：马铃薯块茎。

2．仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3．试剂：L 磷酸缓冲液（pH=）；L邻苯二酚；L磷酸氢二钠；L磷酸二氢钠；10mmol/L 柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）；10mmol/L亚硫酸钠四、实验方法：1.多酚氧化酶的提取取马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在４℃下离心（8000r/min）5min，取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定

多酚氧化酶、抗坏血酸氧化酶的测定方法（一）试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。

2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l 碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。

贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。

贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）方法：1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。

在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。

2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。

然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。

最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。

多酚氧化酶活性测定

A值变化均匀的三组数值求平均值。
多酚氧化酶活性测定多酚氧化酶多酚氧化酶的测定多酚氧化酶活性多酚氧化酶的测定方法多酚氧化酶活力的测定nadph氧化酶活性测定单胺氧化酶活性测定黄嘌呤氧化酶活性测定酶促褐变
实验一
多酚氧化酶（PPO）活性测定
末端氧化酶：处于生物氧化一系列反应的最末端，把电子传递给O2的酶。 1、细胞色素氧化酶 2、交替氧化酶 3、酚氧化酶: 分为单酚氧化酶和多酚氧化酶。 4、乙醇酸氧化酶 5、抗坏血酸氧化酶
四、实验步骤： 1．称取马铃薯0.5克，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，少许 PVP，研磨匀浆，转移到离心管，再用2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液。4℃ 5000rpm离心15分钟，上清液即为粗酶液。 2．在试管中，加入2.5mL pH 7.2磷酸缓冲液，1.5mL 儿茶酚以及1mL 粗酶液，空白调零以1mL磷酸缓冲液代替粗酶液。 3．A值测定：加入粗酶液后迅速混匀，立刻于525nm下测定反应体系的A值，每隔30秒记录一次，共记录5次。 4．计算酶活力。按下式计算 PPO活性＝U/min gFW A值增加0.001定义为一个酶活力单位。
一、实验目的：掌握测定多酚氧化酶活性的方法；了解多酚氧化酶的特性二、实验原理：多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌。醌有颜色，在525nm下有最大光吸收，通过分光光度法测定反应体系颜色变化可测定酶活性。三、器材与试剂 1、仪器：低温离心机、s22pc分光光度计 2、试剂：儿茶酚、pH 7.2磷酸缓冲液 3、材料：马铃薯

多酚氧化酶活性测定

多酚氧化酶活性测定一、引言食品的褐变主要分为酶促褐变和非酶褐变，多酚氧化酶是引起果蔬褐变的主要酶之一，学习它的活性测定对于果蔬加工采取合理的护色措施具有指导意义。

多酚氧化酶的活性测定有多种方法，出于一般实验室的条件相对不是很先进，本试验选用了一种较简单的方法，但这种方法仍然可以训练学生掌握测定酶活性的基本要点和技能。

二、原理邻苯二酚在多酚氧化酶催化下受O作用生成邻苯二醌，邻苯二醌能够被抗坏血酸还原，如抗坏血酸充足，少量邻苯二酚可反复不断地发生氧化还原。

由于该酶最适pH为6，因此这一过程在pH6时最快。

把分析对象配成pH6左右的样液，在抗坏血酸和邻苯二酚存在时，于20°C 下振荡2min，这时抗坏血酸被氧化。

精确的经过2min后加入偏磷酸以终止反应。

用碘量法（以碘酸钾为基准试剂）进行滴定，测得剩余的抗坏血酸。

由得到的数据求出被氧化的抗坏血酸量，并计算出酶活性，并以1g分析物质1min内氧化抗坏血酸的微克分子数表示之。

所有上述过程的主要反应式如下：酶邻苯二酚- --- & 邻苯二醌邻苯二醌+抗坏血酸邻苯二酚+脱氢抗坏血酸KIQ+5KI+6HO H6KCI+3HO+3I23b+3Vb3-脱氢Vc+6HI三、材料和设备苹果；马铃薯。

研钵；烧杯；50毫升量瓶；250毫升三角瓶；秒表；滴定管；温度计。

四、试剂1．0.2 邻苯二酚溶液：用粗天平称0.2 克邻苯二酚，溶解于蒸馏水，稀释到100 毫升，（准备用的前1-2 天配制）。

贮于棕色玻璃瓶中，放在冷凉处。

2. 0.01N碘酸钾溶液：用分析天平精确称取0.3566克KIQ （预先在102C烘2小时，在干燥皿中冷却备用），用蒸馏水溶解于1 升的容量瓶中，加5毫升1N 的NaOH溶液（此时加碱是为了使KIQ和KI在该试剂中暂不反应）和2克KI，溶解，用蒸馏水稀释到刻度，混匀，保存于棕色瓶中。

3. pH6.4的磷酸缓冲液，称取KH2PO4盐5.44克溶解到无碳酸的水中，加10毫升1N的NaOH溶液，用无碳酸的水稀释至200毫升，保存于磨口玻璃瓶中。

多酚氧化酶的测定方法

多酚氧化酶的测定方法试剂：1、0.02mol/l焦儿茶酚溶液：称0.22克焦儿茶酚溶于100毫升蒸馏水中，现用现配。

2、0.1mol/l碘酸钾：0.3567克碘酸钾溶于蒸馏水，定容至100毫升。

3、0.005mol/l碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸馏水中，加冰醋酸1毫升，再加0.1mol/l碘酸钾12.5毫升，最后加蒸馏水定容至250毫升。

4、pH6.0磷酸缓冲液：87.7毫升A+12.3毫升B，用蒸馏水稀释至200毫升。

贮备液A：0.2mol/l磷酸二氢钠（27.6g NaH2PO4·H2O用蒸馏水配成1000ml）。

贮备液B：0.2mol/l磷酸氢二钠（53.65g Na2HPO4·7H2O或71.7g Na2HPO4·12H2O用蒸馏水配成1000毫升）5、其它：1%淀粉；10%偏磷酸；0.1%抗坏血酸（现用现配）方法：1、粗酶提取：称取新鲜样品2克，剪碎，置于研钵中，加入少量pH6.0磷酸缓冲液和少许石英砂，于冰浴中迅速研磨至匀浆，将全部材料用缓冲液冲洗入50毫升容量瓶中，并定容至刻度。

在18~20度下每隔3分钟摇动1次，共5次，然后再静置15~20分钟，其上清液即为粗酶提取液（可倾入干洁的三角瓶中备用）。

2、活性测定：取干洁50毫升三角瓶6只（编号），按照下表向各瓶中加入pH6.0磷酸缓冲液、0.1%抗坏血酸、0.02mol/l 焦儿茶酚，并向③号瓶及⑥号瓶各加10%偏磷酸。

然后将三角瓶置于18~20度水浴或放在室温下使内外温度达到平衡之后，每隔1分钟向各瓶中依次加入酶液2毫升，全部加完后保温3分钟，再按原顺序仍然间隔1分钟向①、②、④、⑤号各瓶加入偏磷酸1毫升（注意：加完2号瓶后应间隔2分钟再加4号瓶），用于终止酶的活性。

最后向各瓶中加入1%淀粉溶液3滴作为指示剂，摇匀后用微量滴定管以0.005mol/l 碘液滴定，当溶液呈现淡蓝色为止，记录碘液消耗量。

多酚氧化酶的测定方法

多酚氧化酶的测定方法
多酚氧化酶的测定方法有多种，常用的方法包括:
1. 分光光度法：利用多酚氧化酶催化产生的还原型多酚吸收UV-Vis光谱上的特征波长，通过测定吸光度确定多酚氧化酶活性。

2. 荧光法：利用多酚氧化酶催化荧光染料的氧化还原反应，测定荧光信号的变化，从而确定多酚氧化酶活性。

3. 比色法：利用多酚氧化酶催化产生的还原型多酚与某些化学试剂发生比色反应，从而测定多酚氧化酶活性。

4. 滴定法：利用多酚氧化酶对还原性物质的氧化作用，滴定一定浓度KMnO4确定多酚氧化酶的活性。

5. 原位测定法：利用电化学方法实时监测多酚氧化酶产生的还原型多酚浓度变化，从而确定多酚氧化酶的活性。

多酚氧化酶活性测定及控制[开题报告]

毕业论文开题报告生物工程多酚氧化酶活性测定及控制一、选题的背景、意义多酚氧化酶（PPO）广泛存在于自然界，在果实和蔬菜收获后，PPO所引起的反应常常会使果肉发生褐变、产生异味和损失营养。

本研究就PPO的活性和影响该酶作用的因素进行阐述，为果蔬贮藏和加工中酶促褐变的防治提供思路。

二、相关研究的最新成果及动态2.1鲜切莲藕组织中多酚氧化酶的分离纯化从鲜切藕中粗提多酚氧化酶，并通过硫酸铵盐析沉淀，DEAE-SepH-Arose离子交换柱层析以及PHenyl SepHArose 6FAsT Flow疏水柱层析进行纯化后，经SDS-PAGE电泳确定为单一条带，表明该酶已被纯化到电泳均一。

在整个过程中，该酶纯化了95．66倍，产率为2．4％。

同时研究表明，鲜切莲藕组织中PPO相对分子质量在65 900～66 100之间。

2.2 不同小麦多酚氧化酶活性检测方法的比较以邻苯二酚和酪氨酸为底物所测PPO活性极显著相关,邻苯二酚所测活性强,但酪氨酸所测活性的变异系数大。

面粉PPO活性和面粉及面制品色泽的变化相关性最强,但籽粒和全麦粉中的PPO活性高,变异系数大。

2.3 PPO活性与小麦粉主要理化指标的关系PPO活性与小麦粉白度成极显著负相关性,与灰分含量成极显著正相关性;前路粉流PPO 活性比后路粉流低;物料含皮较多的在线粉流PPO活性高;物料来源于小麦胚乳外层的粉流PPO活性高。

2.4 核桃组织培养中外植体褐变多酚氧化酶活性的控制在抑制PPO活性方面,PVP作用最明显,其次是NA2S2O3、AGNO3。

2.5 石榴果皮中的多酚氧化酶(PPO)活性测定的最佳试验条件以邻苯二酚为底物时,底物浓度宜大于20mmol/L,其最适波长为420nm,最适pH值为6.8,最适温度为50℃,反应时间不宜超过20min,反应完成后在20min后测定PPO的活性最为稳定。

抑制剂NAHSO4的有效抑制浓度为0.8mmol/L。

2.6 纯化的莲藕多酚氧化酶(PPO)与底物和抑制剂相互作用时的二级结构变化园二色谱分析表明莲藕PPO主要含有α一螺旋和β一折叠结构。

苹果中多酚氧化酶最适 pH 的测定

实验二苹果中多酚氧化酶最适pH 的测定一、实验原理存在于果蔬中的多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）在适宜的条件下能引起果蔬的酶促褐变。

因此，多酚氧化酶对于食品加工具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜离子的酶，它能催化两类不同的反应。

一是一元酚羟基化，二是邻-二酚氧化。

在一些植物中，多酚氧化酶能同时催化这两类反应；而在另一些植物中，多酚氧化酶仅能催化邻-二酚氧化，却不能催化一元酚羟基化。

如果采用邻-二酚作底物，那么随着酶催化反应进行，反应混合物的吸光值因邻-苯醌的量的增加而增大，因此可采用分光光度法测定多酚氧化酶的活力。

二、试剂和仪器试剂：0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别为3.6、4.0、4.6、5.0和5.6、0.2mol/L 磷酸盐缓冲液，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0、0.01mol/L儿茶酚溶液、0.05mol/L 磷酸盐缓冲液，pH=6.5、丙酮仪器：组织捣碎机、抽滤装置、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器、离心机三、实验步骤1、从苹果中萃取多酚氧化酶将100 g苹果迅速去梗和核后切成小块，和400mL左右预先冷冻至－26℃的丙酮一起倒入组织捣碎机中均质（20,000 rpm，2 min），然后迅速抽滤，保留滤纸上的沉淀部分，将沉淀薄层中残留的丙酮用冷风吹去，至沉淀无丙酮味。

将所得丙酮粉转移至150 mL 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中，搅拌30 min，然后离心（4℃,10000 r/m,20 min），离心所得上清液如有混浊，则用8层纱布过滤，从而得到多酚氧化酶提取液。

2、不同pH下多酚氧化酶活力的测定在比色皿中分别加入1.8~1.1 mL pH为3.6的缓冲液和0.7mL儿茶酚溶液，搅匀后加入0.5~1.2mL多酚氧化酶提取液，迅速搅匀，测定反应混合物在400 nm 下的吸光值随时间的变化，参比以缓冲液代替酶液。

甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制

甘薯中多酚氧化酶活性的测定及褐变控制一、本文概述本文旨在探讨甘薯中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）活性的测定方法，并深入研究如何控制甘薯在加工和储存过程中因PPO活性过高引发的褐变现象。

甘薯作为一种重要的农作物，其营养价值和经济价值均较高，但在加工和储存过程中，甘薯常因PPO的作用而发生褐变，这不仅影响了甘薯的外观品质，还可能降低其营养价值，甚至影响消费者的接受度。

因此，研究甘薯中PPO活性的测定方法和褐变控制技术，对于提高甘薯的加工品质和储存稳定性具有重要的理论和实践意义。

在本文中，我们将首先介绍PPO的基本性质及其在甘薯中的功能，然后详细阐述PPO活性的测定方法，包括常用的比色法、光谱法等。

接着，我们将分析甘薯褐变的原因和机理，探讨影响PPO活性的各种因素，如温度、pH值、抑制剂等。

在此基础上，我们将提出一系列控制甘薯褐变的策略和方法，如物理法、化学法和生物法等，并对各种方法的优缺点进行比较和评价。

我们将对甘薯中PPO活性的测定及褐变控制的研究前景进行展望，以期为甘薯的加工和储存提供更为有效的技术支持。

二、甘薯中多酚氧化酶的活性测定在甘薯中，多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是一种关键的酶，参与了甘薯褐变的过程。

为了更深入地了解甘薯褐变的机制并寻找有效的褐变控制方法，对甘薯中多酚氧化酶的活性进行精确测定显得尤为重要。

测定多酚氧化酶活性的方法主要基于酶催化底物氧化产生有色产物的原理。

在本研究中，我们采用了经典的邻苯二酚法来测定甘薯中多酚氧化酶的活性。

将甘薯样品进行匀浆处理，以获得含有多酚氧化酶的酶液。

然后，将适量的酶液与底物邻苯二酚混合，并在适宜的温度和pH条件下进行反应。

随着反应的进行，邻苯二酚被多酚氧化酶催化氧化，生成有色产物。

通过测定有色产物的吸光度，可以间接反映多酚氧化酶的活性。

为了获得准确的结果，我们在测定过程中严格控制了实验条件，包括温度、pH值、底物浓度和反应时间等。

多酚氧化酶活性的测定

实验五多酚氧化酶活握测定多酚氧化酶活性的方法及原理，理解诸如：果实受伤、组织变褐的原因等。
二、原理与方法多酚氧化酶（PPO）催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液PH6.0的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD 值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
五、实验结果记录及分析：以每分钟A410变化0.01为一个多酚氧化酶活性单位（u）
A V 410 T 多酚氧化酶活性 [ u /g （ m ） in ] W V 0 . 01 t S
式中：A410：反应时间内吸光度的变化， W：样品鲜重g， t：反应时间min，本次实验为5min， VT：提取酶液总体积ml， Vs：测定时取用酶液体积ml。
二原理与方法二原理与方法多酚氧化酶多酚氧化酶ppo多酚氧化酶多酚氧化酶是采用邻苯二酚为底物在是采用邻苯二酚为底物在02m冲液冲液ph60ph60的反应体系中的反应体系中ppo在分光光度计在分光光度计410nm410nm处使反应体系的值上升的读数变化确定值上升的读数变化确定ppoppo催化各种酚与催化各种酚与o2催化各种酚与催化各种酚与02m磷酸氢二钠ppo催化邻苯二酚形成褐色的醌催化邻苯二酚形成褐色的醌处使反应体系的odod值产生变化通过ppo的酶活大小
三、实验材料、仪器与试剂 1.材料：马铃薯； 2.仪器：恒温水浴、分光光度计、试管等； 3.试剂： 0.5%邻苯二酚溶液、0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液（PH6.0）。
四、实验方法： 1.设计样品（自购）的不同贮藏条件，提前贮藏样品以进行测定。 2.酶液的制备：称取样品5.0g，用预冷蒸馏水研磨匀浆，定容至 100ml，在18-20℃下浸提30分钟，中间摇动数次，过滤备用。 3.测定：（1）对照：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1mL灭酶后的酶液，2mL蒸馏水，以此调零。（2）样品测定：在含有6mLpH6.0的0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入1mL0.5%邻苯二酚溶液，在30℃恒温水浴中预热后加入1mL酶液， 2mL蒸馏水，反应5分钟，加热灭酶以终止反应，以5000r/min离心10分钟，取上清液备用。在 410nm下测定吸光度。

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定1.1基本原理：多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。

在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。

因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。

1.2实验试剂和仪器：a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）b．试剂1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3）50mmol/L邻苯二酚溶液取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。

1.3实验步骤1）酶液制备称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

多酚氧化酶的测定

多酚氧化酶活性的测定采用李军红等的方法，略加修改。

称取0.5g全麦粉，加入5ml,0.1mol/l,pH5.6的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液,4sheshidu提取过夜。

5000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

反应混合液为4ml提取缓冲液加1ml 0.1mol/l的邻苯二酚，对照不加邻苯二酚，以缓冲液代替，37sheshidu下精确反应15min，在722S分光光度计上读取420nm处的吸光值，A420读数增加1.00所需的酶量定义为一个酶活单位。

磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH5.6、0.1mol/l：0.2mol/l磷酸氢二钠 11.6ml0.1mol/l 柠檬酸 8.4ml小麦多酚氧化酶火星的基因型、环境极其互作效应的分析胡瑞波，田纪春，吕建华。

中国粮油学报，2004年2月，第19卷第一期全麦粉离心法测定PPO活性，称取全麦粉0．50 g，加入柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH值6．0)5 ml，混匀后在4℃下过夜提取，于4℃、4000r／min离心15min。

取2ml缓冲液和0．5ml酶液于40℃水浴5min，再加入1 ml邻苯二酚，混匀后于420nm波长下测定15 min内吸光值的变化PPO 的活性(u)表示为△A×1000／min。

小麦多酚氧化酶特性及河边控制研究黄海霞，张真，吴金芝安徽农业科学008，36(31)：13574—13575，13638酶液的提取酶液的提取按Kruger 等和Taneja 等方法进行作了部分修改 .20粒小麦种子加5ml蒸馏水浸泡 25h左右 .全麦粉 5g加柠檬酸 -磷酸缓冲液 (ph6.8)50ml.搅拌静置反复几次20000g/4sheshidu离心 15min,取上清液于 4sheshidu冰箱保存备用活性检测活性检测按 Kruger等方法作了部分修改取 1ml酶液和 2ml邻苯二酚(0.1mol/l)于37sheshidu 水浴 5min,然后在比色皿中混合 ,405nm波长下测定 5min内吸光值的变化. PPO的活性表示为△A×1000／min。

多酚氧化酶活性测定

实验二十六植物体内多酚氧化酶活性的测定一、目的经过实验，掌握植物体内多酚氧化酶活性的测定方法。

二、原理多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在有氧的条件下，能使一元酚和二元酚氧化产生醌。

用分光光度法在 525nm 波长下测其吸光度，即可计算出多酚氧化酶的活力和比活性。

反应式以下：多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）＋1∕2 O2——————→邻醌＋ H2O三、资料、仪器及试剂1.资料：马铃薯块茎等2.仪器：UV－1206 或UV－1240 分光光度计；离心计；恒温水浴；研钵或匀浆机；试管；移液管；纱布袋等。

3.试剂：聚乙烯吡咯烷酮（ PVP）； 0.01mol ·L－1pH 6.5 磷酸缓冲液； 0.1mmol·L－1－1pH6.5 磷酸缓冲液； 0.05mol LpH5·.5 磷酸缓冲液； 30%饱和度硫酸铵； 0.1－1mol ·L儿茶酚；20％三氯乙酸。

四、实验步骤1.粗酶液的制备称取马铃薯块茎5g 于研钵中，加入0.5g 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（早先用蒸馏水浸洗，尔后过滤以除去杂质）和100ml0.1mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液 ,磨成匀浆，用几层纱布袋过滤，滤液加入30%饱和度硫酸铵，离心除积淀，上清液再加硫酸铵使达 60％饱和度，离心收集积淀。

将所得积淀溶于2～3ml0.01mol ·L－1pH6.5 磷酸缓冲液中，即为粗制酶液。

2.活性酶的测定在试管中加入 3.9ml 0.05 mol L－·1pH5.5 磷酸缓冲液， 1.0ml 0.1 mol L －·1 儿茶酚在 37℃恒温水浴中保温 10min，尔后加入 0.5ml 酶液（可视酶活性增减用量），迅速摇匀，倒入比色杯内，于 525nm 波长处以时间扫描方式，在 1～2min 内测定吸光度变化（ A）值。

五、酶活性的计算以每 min 内 A525 值变化 0.01 为 1 个酶活力单位，按下式计算多酚氧化酶的活力和比活性。

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书

多酚氧化酶（PPO）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC0190规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶4℃保存粉剂一粉剂×1瓶4℃保存试剂一液体40 mL×1瓶4℃保存试剂二液体10 mL×1瓶4℃保存溶液的配制：1、提取液：临用前将粉剂一倒入提取液中，溶液为悬浊液，使用前需摇匀。

产品简介：PPO主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。

PPO能够催化邻苯二酚产生醌，后者在410nm有特征光吸收。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次）；8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

2.称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。

8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测。

3.血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤1、分光光度计预热30min以上，调节波长至410nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）试剂名称（μL）测定管对照管试剂一600600试剂二150150样本150煮沸的样本15037℃(哺乳动物)或25℃（其它物种）中准确水浴10min后，迅速放入沸水中加热10min。

冷却后，5000g，常温离心10min，收集上清，410nm处检测测定管和对照管吸光度，计算ΔA=A测定-A对照。

邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性

邻苯三酚比色法测定土壤多酚氧化酶活性试剂配制(1)1%邻苯三酚溶液 (2)乙醚。

(3)0．5N盐酸。

(4)重铬酸钾标准溶液——o．75g重铬酸钾溶于1升0.5NHCl(相当于50mI醚中含5mg紫色没食子素)。

(5)pH4．5柠檬酸——磷酸缓冲液。

标收曲线绘制：取重铬酸钾标准溶液，用o．5N HCI稀释成各种不同浓度。

定容后，在分光光度计上于430nm处比色测定。

以光密度位为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准曲线。

2。

投作步骤取1g土样(过o．25mm筛)，置于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1％邻苯三酚溶液，将瓶内含物摇荡后放在30度恒温掐小培养2h。

取出后加4mlpH 4．5柠檬酸——磷酸缓冲液，再加35ml乙醚，用力摇荡数次，萃取30min。

最后，将含溶解的紫色没食子素的着色乙醚相进行比色。

比色时用波长为430nm的滤光片。

为防止因乙醚引起的误差，每比色一次用元水乙醇洗涤比色液槽一次。

为了消除土壤中原有的醚溶性有机物质而引起的误差及校正没食于酚的纯度，需设无基质的土壤和无土壤的基质作对照。

在无基质的土壤的对照中，用水代替基质进行培养。

3．活性表示紫色没食子索的量，根据用重铬酸钾绘制的标准曲线查知。

多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色没食子素的毫克数表示。

我不知道找个“紫色没食子素”是什么意思？是不是要找个试剂啊？我问了几个老师，他们都没有听说过这个试剂。

我的有的药品冯老师本来说他那有，可是我做的时候去找了，缺了几个，王老师说想办法买了，已经给李老师说了，买了后做，这几天榆林大风降温，那个移栽没有办法进行，上面红颜色的我不知道怎么做了，萃取不知道是萃取什么，看不太懂，还有测那个中性磷酸酶时的酚溶液是苯酚加水就可以了么？我这几天在图书馆查了很多资料，可是都没有啥结果（配制方法：在大烧杯中加入80mL去离子水，再加入300g 苯酚，在水浴中加热搅拌、混合至苯酚完全溶解。

将该溶液倒入盛有200mL去离子水的1000mL分液漏斗内，轻轻振荡混合，使其成为乳状液。

多酚氧化酶(PPO)检测

多酚氧化酶（PPO）检测
多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO），又称为儿茶酚氧化酶，是一类含铜的氧化还原酶，广泛存在于植物、真菌、昆虫的质体中，甚至在土壤中腐烂的植物残渣上都可以检测到多酚氧化酶的活性。

多酚氧化酶在茶中的主要作用是催化儿茶素形成邻醍，进一步形成茶黄素等色素物质和香气成分等。

PPO的共同特征是能够通过分子氧氧化酚或多酚形成对应的醌。

在广义上，可分为三大类：单酚单氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶catechol oxidse）和漆酶（laccase），现在所说的多酚氧化酶一般是儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。

迪信泰检测平台采用生化法，可高效、精准的检测多酚氧化酶的活性变化。

此外，我们还提供其他氧化应激类检测服务，以满足您的不同需求。

生化法测定多酚氧化酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。

周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关参数（中英文）
3. 图片
4. 原始数据
5. 多酚氧化酶含量/活性信息。

实验四多酚氧化酶的活性的测定及酶学性质

一、实验目的1掌握分光光度法测定多酚氧化酶活性的一般原理及操作技术方法。

2了解酶的活性与植物组织褐变以及生理活动之间的关系。

二、实验原理马铃薯不耐储藏，在加工过程中去皮切分后非常容易发生酶促褐变，使外观品质和营养价值大为降低，制约着马铃薯的开发利用。

酶促褐变是马铃薯加工产业必须解决的难题。

其中多酚氧化酶是导致马铃薯等果蔬发生酶促褐变的重要酶类。

多酚氧化酶活性大小直接影响酶促褐变程度。

多酚氧化酶（polyphenoloxidase, PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶等.是自然界中分布极广的一种含铜氧化酶•普遍存在于植物、真菌、昆虫的质体中。

植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与02氧化形成醌，使组织形成褐变.以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。

研究多酚氧化酶的特性对食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。

因此，检测食品中多酚氧化酶具有重要意义。

多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，在一定的温度、pH条件下，有氧存在时，能使催化邻苯二酚氧化生成有色物质，单位时间内有色物质在410 nm处的吸光度与酶活性强弱成正相关，在分光光度计410nm处使反应体系的0D值产生变化，通过0D值的变化确定PPO的酶活大小。

多酚氧化酶邻苯二酚（儿茶酚）+ 1 / 2O2 -------------------------------- 邻醌+ H2O三、试验材料、试剂及试验用品1. 材料：马铃薯块茎。

2. 仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴；研钵；试管；移液管；容量瓶3 .试剂：0.1mmol/L 磷酸缓冲液（pH=7.0）；0.01mol/L 邻苯二酚；0.1mol/L 磷酸氢二钠；0.1mol/L 磷酸二氢钠；10mmol/L柠檬酸；10mmol/L抗坏血酸；10mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA ）；10mmol/L 亚硫酸钠四、实验方法：1•多酚氧化酶的提取取0.5g马铃薯块茎样品，加入预冷的磷酸缓冲液（pH7.0）3ml，研磨匀浆，转移到离心管中，再用7mL磷酸缓冲液冲洗研钵，合并提取液，在4C下离心（8000r/min）5min,取上清液为多酚氧化酶提取液，并量取粗酶液体积。

多酚氧化酶的纯化和活力测定

多酚氧化酶的纯化和活力测定实验原理很多植物受到机械损伤时在空气中会逐渐变成褐色，这是损伤时植物细胞破碎，原来彼此分开的多酚氧化酶和多酚类物质接触反应的结果。

反应如下：＋H2O多酚氧化酶＋1/2O2多酚氧化酶(po1yphenoloxidase，PP0)是一种含铜酶，它能够催化酚类物质转变成醌。

近几十年来，国内外对植物组织褐变的研究表明，组织的褐变主要是PP0作用于天然底物酚类物质所致试剂和器材一、试剂0.025mol/L磷酸钾缓冲液（ pH7.2）；0.15mol/L儿茶酚溶液；10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）；硫酸铵。

二、材料梨。

三、器材组织匀浆机，漏斗，滤纸，分光光度计。

操作方法一、多酚氧化酶(PP0)的提取1. 丙酮粉制备：取果肉组织100 g，加入200mL冰丙酮(—20℃左右)，用高速组织捣碎机匀浆5min，混合液用中速滤纸在漏斗架上过滤，残渣用冰丙酮反复冲洗，过滤，直至成为白色粉末，此粉末即为丙酮粉。

2.酶液制备：称取1g丙酮粉，加入20ml 0.025mol/L磷酸缓冲液（ pH7. 2），0℃下用磁力搅拌器匀浆30min，在12 000rpm下离心30min，取上清液，得粗酶提取液。

二、多酚氧化酶(PP0)的纯化向上述酶液中加入NH4SO4至为80％饱和溶液，搅拌30min, 过夜，于12 000g离心30min，沉淀溶于0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2）, 对10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）透析18h, 期间更换三次，即为纯化多酚氧化酶。

三、多酚氧化酶(PP0)活力的测定以儿茶酚为底物，在1cm的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸缓冲液中（pH7.2）， 0.1mL 0.15mol/L儿茶酚溶液，混匀，室温下放置3分钟后，加入0.1mL酶液, 5s后开始扫描1min内A420值的变化，酶活性以每分钟光吸收值改变0.001所需的酶量为1个活力单位。