LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究

LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的对比探究

目的：研究LAMP法和PCR法在阪崎肠杆菌快速检测中的差异，指导临床在阪崎肠杆菌快速检测中方法的选择。方法：针对阪崎肠杆菌的OmpA基因，设计相关特异性引物，分别建立LAMP法和PCR法两种检测方法体系对其进行检测，并对两种检测方法的灵敏度进行记录比较；分别采用两种方法对45株阪崎肠杆菌近源菌进行检测，分析比较两种方法的特异性；最后采用两种方法对60份商场奶粉样品进行检测，将检测结果与FDA检测结果进行比较分析。结果：两种检测方法的灵敏度检测结果显示：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度（101 cfu/ml）明显高于PCR法（102 cfu/ml），两者比较差异有统计学意义（P ＜0.05）；在对45株阪崎肠杆菌近源菌的检测中，显示LAMP法有5株阪崎肠杆菌出现阳性结果，而PCR法则显示非特异性条带，表明LAMP法检测的特异性明显优于PCR法。结论：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测有效可行、灵敏度高、特异性强，是临床进行阪崎肠杆菌快速检测的一种有效方法。

标签：LAMP；PCR；阪崎肠杆菌

阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，是奶粉（乳）制品中新发现的一种致病菌。由其可引发婴儿各种疾病，致病机制可能与其侵入、诱导凋亡及肠毒素作用有关[1]。对于阪崎肠杆菌的检测，最新研究发现LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测，灵敏度高、特异性强[2]。笔者所在医院应用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测的进行对比探究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 菌株标本

所研究的菌株共60株，其中2株阪崎肠杆菌标准菌株是由广东省微生物研究所提供的ATCC51329和ATCC29544，8株阪崎肠杆菌野生菌株是采用FDA 传统手段从商场奶粉或果汁中提取出来的；其余在试验中用到的菌株均为本实验室自己保存。

1.2 仪器

细菌基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司），Bst DNA Polymerase（美国NEB公司），betaine（美国Sigma公司），agarose（Promega），DK28D型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司），PCR仪：PTC-200型；美国Bio-rad公司，EPS301电泳仪（瑞典Amersham公司）。

1.3 方法

采用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌进行快速检测具体分为以下步骤。

1.3.1 分别建立LAMP法和PCR法的快速检测体系具体操作为：（1）菌株培养：将全部细菌接种于适量的增菌液中，其中将阪崎肠杆菌接种胰蛋白胨肉汤，其余菌株接种于普通营养肉汤中；（2）基因组DNA的提取：采用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌DNA，操作按照试剂盒上相关说明进行；（3）引物的设计：①LAMP法引物设计：针对阪崎肠杆菌的OmpA基因，设计合适的特异性引物，引物是由上海生工生物工程技术服务有限公司合成的；②PCR法引物设计：根据传统的PCR法检测所需配制的相关试剂结合仪器，配制合适的PCR 法反应体系进行检测。

1.3.2 LAMP法和PCR法两种方法灵敏度的检测将选取的菌株进行101～106的10倍倍比的稀释，然后分别选取各稀释倍数的菌液100 μl进行平板计数；再取各稀释倍数的菌液1 ml，提取其中的DNA，选取上清液2 μl作为模板，进入到LAMP和PCR体系中进行检测，分别分析检测灵敏度。

1.3.3 采用LAMP法和PCR法对菌株进行检测，并分析两种方法检测的特异性。具体操作为：（1）菌株选定：所选用的菌株共55株（其中阪崎肠杆菌10株，阪崎肠杆菌近源菌45株）；（2）分别采用LAMP法和PCR法进行菌株扩增；（3）通过电泳，观察扩增结果。

1.3.4 实际奶粉样品的检测对比分析分别采用已经建立起来的LAMP和PCR体系对所选取的商场奶粉进行检测。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.0统计学软件对数据进行分析统计，计数资料采用字2检验，计量资料采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP法和PCR法两种方法灵敏度的对比分析

取细菌培养物进行平板计数，已测定的初始菌液浓度为2×106 cfu/ml，对其10倍倍比稀释液，分别采用LAMP法和PCR法进行检测。发现LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度（101 cfu/ml）明显高于PCR法（102 cfu/ml），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

2.2 LAMP法和PCR法两种方法特异性的对比分析

采用LAMP法和PCR法对全部菌株进行检测，并分析两种方法检测的特异性。结果发现在对45株阪崎肠杆菌近源菌的检测中，显示LAMP法有5株阪崎肠杆菌出现阳性结果，而PCR法则显示非特异性条带，表明LAMP法检测的特异性明显优于PCR法。

2.3 实际奶粉样品的检测对比分析

采用两种方法对60份商场奶粉样品进行检测。将检测结果与FDA检测结果进行比较分析发现，检测结果完全一致。具体如图2。

3 讨论

阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达50%以上。对于阪崎肠杆菌的检测，李雪玲等[3]学者在研究中发现，分子信标-实时PCR法快速检测阪崎肠杆菌灵敏度高，适用于婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌的快速检测。PCR法是目前基因诊断中使用最多的方法。已有研究将PCR法应用于乙型肝炎病毒基因型检测中，检测效果良好[4]。且已有相关研究发现，PCR 对于结核杆菌检测的优越性显著，有较好的诊断价值[5]。但是，杨伟洪等[6]学者发现，PCR法检测过程中存在操作复杂，灵敏度低的不足，有待进一步改进方法。LAMP法是一种新型的基因诊断方法，已有研究将其应用于结核杆菌的常规检测中去[7]。范宏英等[8]学者分别应用LAMP法和PCR法对阪崎肠杆菌快速检测，发现LAMP法比PCR法检测灵敏度更高，值得推广应用。

本研究显示，两种检测方法的灵敏度检测结果显示：LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测的敏感度明显高于PCR法（P＜0.05）；在对45株阪崎肠杆菌近源菌的检测中，显示LAMP法有5株阪崎肠杆菌出现阳性结果，而PCR法则显示非特异性条带，表明LAMP法检测的特异性明显优于PCR法。

总之，LAMP法对阪崎肠杆菌快速检测灵敏度高、特异性强，可作为阪崎肠杆菌快速检测的一种有效方法。

参考文献

[1]胡光春，杨月莲，刘辉，等.阪崎肠杆菌致病性及致病机理研究进展[J].中国病原生物学杂志，2011，6（8）：626-628.

[2]张淑红，吴清平，徐晓可，等.LAMP法在阪崎肠杆菌快速检测中的应用[J].食品与机械，2011，27（5）：111-114.

[3]李雪玲，陈勇，张莉，等.分子信标-实时PCR法快速检测阪崎肠杆菌的研究[J].中国卫生检验杂志，2011，21（9）：2136-2138.

[4]夏献颗，郭佐华.采用PCR法对乙型肝炎病毒基因型检测的临床观察与分析[J].中国医药指南，2012，10（1）：68-69.

[5]孙集思，陈亦洋.PCR法检测痰液结核杆菌对诊断价值的研究[J].中国社区医师，2012，14（2）：266.

[6]杨伟洪，陈罡，罗殿中.PCR检测结核杆菌的优越性及局限性分析[J].国际医药卫生导报，2006，12（10）：141-144.