HPLC-NMR在线联用系统及其应用

Flurbiprofen
Ibuprofen
Indomethacin
Naproxen
Anal. Chem.2000, 72,3922-3926
HPLC-NMR在线联用系统在复杂体系分离检
测中表现出了强大的生命力，以后必然能
够得到更广泛的应用。
The end
Thanks!
Seminar Ⅰ HPLC-NMR在线联用系统及其应用 学生：张洁 导师：张玉奎
通常与HPLC联用的技术
常用的分析手段： HPLC-RI: 通用型检测器，灵敏度差，不适合梯度洗脱 HPLC-ELSD：通用型检测器，灵敏度差，不能提供结构信息 HPLC-UV ： ①对不具有发色基团的有机化合物响应差 ②提供的化学结构信息远不够丰富 HPLC-MS ： ① 由于离子化问题,对部分化学成分的响应差,不能分析所有结构类型的化合物; ②对色谱流动相的组成有限制,不宜使用非挥发性缓冲盐; ③所提供的化学结构信息尚不足以彻底解决化合物的鉴定问题,尤其对阐明基 团连接位置和立体构型等缺乏证据。 HPLC-NMR
利用这种联用装置，Hansen等人鉴定出了该萃取物中的所有已报道的化合物，而 且得到了两种新的化合物。 Anal. Chem.1999, 71,5235-5241
RP-HPLC combined with on-line DAD, FT-IR and 1H-NMR and TOF-MS: Application to a mixture of nonsteroidal anti-inflammatory drugs
峰存贮模式
应用领域
药物杂质鉴定 环境样品 聚合物产物
药物体内外代谢产物的结构鉴定
组合化学合成产物分析
天然产物研究
维生素E异构体分离图
RP-HPLC-1H-NMR on-flow method
Journal of Chromatography B, 748 (2000) 233–258
HPLC-NMR
NMR的优势： 高度的通用性 不破坏样品 最强大的结构解析能力 LC与NMR 直接联用的设想始于70 年代， 90 年代后期逐渐发展成熟。
离线接口和连续流动接口
Flow cell: U-shaped, 2-4mm i.d.,30-200ul
灵敏度
提高灵敏度的方法： 1. 2. 3. 利用SPE等方法浓缩样品 提高磁场强度 （９００MHz NMR已经商品化） 降低探头温度 （商品化的低温探头）
LC-NMR 的基本操作模式
连续流动模式(on-flow)
优点：一次分析可得到所有组分的 NMR 信息 缺点：所获得的NMR 图谱质量较差
停流模式(stop-flow)
优点：NMR谱图质量较好 缺点：存在明显的峰展宽，而且分析时 间较长 色谱峰被收集并暂时贮存到不同的毛 细管回路内,由NMR 谱仪逐一测定各 流分。
组合肽库的分离检测
600 MHz H NMR . The labels at the right hand side denote the classes of tripeptide, A2M refers to the three compounds: A–A–M–NH2 , A–M–A–NH2 , M–A–A–NH2. 丙胺酸(A) 蛋氨酸(M) 酪氨酸(Y)
溶剂抑制技术
由于常用的MeOH-H2O和MeCN-H2O体系在 NMR中有很强的响应值，可能掩盖分析对 象，因此必须采取一些方法来抑制溶剂干 扰。 1. 采用氘代溶剂
价格昂贵－－适合于µHPLC
2. 3.
通过不同频率通道进行多重溶剂峰预饱和 脉冲梯度场的相位离散而消除溶剂干扰
常见HPLC-NMR的示意图
Leabharlann Baidu
峰存贮模式(peak
parking or loop-collection)
停流模式流程
固定时间间隔 峰强度，保留时间 色谱峰切割 流动探头
优化后NMR参数 目标峰
NMR system
NMR试验： A 完成计算机匀场 B 优化溶剂峰抑制 C 调节接收增益 D 采一维谱 E 按信噪比阀值终止采样 F 如果需要，进一步采样(二维)
Mag. Reson. Chem. 33 (1995) 857.
Analysis of an unstable derivative
Phytochem. Anal. 14 (2003) 73
HPLC-UV-NMR-MS平台
Analysis of Hypericum perforatum L. with HPLC-NMR-MS