禽蛋溶菌酶的制备及改性研究进展

收稿日期：2011-05-04修回日期：2011-06-07*通讯作者，E-mail ：libinfood@1溶菌酶简介溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称胞壁质酶，能水解N-乙酞葡萄糖胺与N-乙酞胞壁酸之间的β-1，4糖苷键。

对溶菌酶的研究最早始于上世纪初，英国细菌学家Alexander Fleming 发现这种能溶解细菌细胞壁的酶大量存在于人的唾液、眼泪中，具有溶菌作用，因此被命名为溶菌酶。

此后人们发现溶菌酶广泛存在于高等动物组织及分泌物、植物和各种微生物中，在新鲜鸡蛋清中含量最高，多数商品溶菌酶是从蛋清中提取纯化而来。

溶菌酶是一种碱性蛋白质，可溶于水，不溶于丙酮、乙醚，无臭、味甜，能分解黏多糖，可通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌，在酸性溶液中十分稳定，耐热，在水溶液中遇碱易被破坏，最适pH 6.5，有抗菌、抗病毒、止血、镇痛、加快组织修复等功能，且对人体无毒副作用，具有广阔的应用前景。

2禽蛋溶菌酶的结构特点蛋清溶菌酶是一种稳定的碱性球蛋白，由129个氨基酸残基组成。

单一肽链，分子量为14388Da ，等电点为10.7～11.0，分子内含4对二硫键。

Phillips 等［1］用X 射线衍射法（XRD ）分析了鸡蛋清溶菌酶的三维结构，发现溶菌酶分子构象复杂，近椭圆形，大小为4.5nm ×3.0nm ×3.0nm ，其中α螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的β片层结构。

Alexander 等［2］研究发现溶菌酶的内部几乎是非极性的，疏水相互作用在溶菌酶的折叠构象中扮演着重要的角色，分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂缝，此裂缝即溶菌酶的活性部位，此活性中心为Asp52和Glu35。

Kobayashi 等［3］研究了溶菌酶晶体的光学活性，阐明了酶结构在溶液和晶体两种状态下变化的定量关系。

Annelise 等［4］在采用AFM 绘制了溶菌酶毫微米级的构象图形，从而确定了溶菌酶在生物反应中专一分子受体的部位。

3溶菌酶的作用机理溶菌酶主要通过肽链中Glu35和Asp52所构成的活性中心水解细菌细胞壁的肽聚糖结构，从而杀灭细菌，肽聚糖是由N-乙酞葡萄糖胺、N-乙酞胞壁酸和一种小肽构成的。

溶菌酶就是通过作用于肽聚糖NAM 的C1与NAG 的C4之间的β-1，4糖苷键从而使肽聚糖骨架结构断裂，细胞壁损伤，最终导致菌体细胞溶解，直至死亡。

4溶菌酶的制备方法Ruckenstein 等［5］研究发现禽蛋尤其是鸡蛋清禽蛋溶菌酶的制备及改性研究进展吴晓芳，李斌*，黄婷，汪师帅，马美湖（华中农业大学食品科技学院，湖北武汉430070）摘要：溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的糖苷水解酶，是天然防腐剂，广泛存在于自然界中，特别是禽蛋中。

但是天然溶菌酶是一种非广谱抗菌剂，主要作用于革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，近年来，很多学者研究了对溶菌酶的改性方法，使其达到对革兰氏阴性菌的抑制作用。

本文综述了禽蛋溶菌酶的结构特点、抗菌机理，重点介绍了禽蛋溶菌酶的分离纯化方法以及国内外对溶菌酶进行物理、化学、生物改性的研究进展，并展望了禽蛋溶菌酶改性的发展前景。

关键词：溶菌酶；结构；作用机理；纯化方法；改性中溶菌酶的含量较高，约占3.5%，是提取溶菌酶的最佳来源。

目前比较热门的制备方法主要是离子交换法、超滤法、亲和色谱法、反胶团萃取法等。

4.1离子交换法离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的技术。

李蓉等［6］采用色谱分离法分离纯化蛋清中的溶菌酶，填充柱填料为硅胶基质弱阳离子交换剂XlDACE-WCX ，这种填料克服了离子交换剂再生困难和交换柱易堵塞的缺点，取得了较好的分离效果，蛋白的比活为1467U ／rag ，溶菌酶活性回收率为107％，纯化倍数提高了5.6倍。

Ghosh ［7］采用PVDF （即二氟化树脂）膜从蛋清中分离溶菌酶，PVDF 膜可以通过离子交换原理选择性地结合溶菌酶，它对很多酸类和有机溶剂都有抑制作用，具有优越的热稳定性、耐候性、化学惰性及柔韧性，加热复性也不会改变膜的孔度，不易堵塞，与其他膜相比较耐用性更强。

Bayramoglu 等［8］用壳聚糖甲基丙烯酸离子交换法从蛋清中分离溶菌酶，取得了较好的效果，用液相色谱鉴别纯度高达94%。

4.2超滤法超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一，是在压力差的驱动下，用可以阻挡不同大小分子的滤板或滤膜将液体过滤。

Ghosh ［9］报道采用小型的中空纤维超滤系统从蛋清粉中分离纯化溶菌酶，中空纤维超滤系统具有质轻、纤度均匀、耐老化、抗腐蚀、高强力、热收缩小、断裂强度大等优点，溶菌酶能够选择性地透过超滤膜，而蛋清中其他大分子蛋白质被截留，同时改进系统的流体动力学使溶菌酶透过率增加，从而获得较好的得率。

4.3亲和色谱法亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一种分离生物大分子的色谱方法。

目前比较热门的溶菌酶分离的亲和层析法有亲和过滤法、固定金属亲和层析法、染料亲和层析法以及亲和沉淀法等。

Vaidya 等［10］采用酸性单体与N-异聚丙烯酰胺的共聚物从蛋清中采用热沉淀法提纯溶菌酶，得到90%的收率，他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH 敏感聚合物效果更好。

Basar ［11］采用悬浮聚合法在Fe 3O 4纳米微粒存在条件下制备了活性蓝固载的磁性聚甲基丙烯酸β-羟基乙酯，通过建立吸附动力学模型，研究了不同条件下其对溶菌酶的吸附效果的影响，并将其用于蛋清溶菌酶的分离纯化中，得到溶菌酶纯度为87.4%，回收率79.6%。

卜春苗等［12］将3.0μm 无孔单分散亲水性交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯树脂为基质，与活性蓝F3GA 反应，制备出一种固定化染料聚合物高效亲和色谱填料，研究了其对溶菌酶的吸附行为，并使用这种填料成功地从鸡蛋清中分离纯化了溶菌酶，纯度达95%。

4.4反胶团萃取法反胶团是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发的向内聚集而成，内含微小水滴的空间尺度仅为纳米级的集合型胶体，是一种自我组织和排列而成的，并具有热力学稳定的有序构造。

胶团内含的微小水滴形成一个微型水池，蛋白质、核酸、氨基酸等生物大分子物质可溶解在其中，由于胶团具有屏蔽作用，有机溶剂不能直接与这些生物大分子作用，可保护其生物活性，从而实现物质的溶解与分离。

Sun 等［13］采用一种由辛巴蓝F3G-A 与改良的大豆卵磷脂在正己烷中反应制得的亲和染料基质反胶团系统从鸡蛋清粗溶液中纯化溶菌酶。

研究表明用这种方法对鸡蛋清粗溶液进行分离纯化，可达到0.62～0.76mg/mg 蛋白，溶菌酶的纯度提高16～20倍，同时这种亲和反胶团可以重复使用。

目前溶菌酶的这些提取方法各具优缺点。

离子交换法具有高效、简便、可自动化操作、成本低等优点，因此一直广泛用于溶菌酶的生产提纯中，但是同时也具有一些难以避免的缺点，如会产生过量的再生废液，周期较长，有机物的存在会污染离子交换树脂等。

超滤法在常温下进行，无需添加化学试剂，条件温和，溶菌酶性能不会被破坏，同时仅采用压力作为膜分离的动力，分离装置简单、流程短、操作简便、易于控制和维护，无污染，是目前比较节能环保的一种分离溶菌酶的方法。

但是超滤法也有一定的局限性，不能直接得到溶菌酶干粉制剂，而且提纯浓度不是很高。

亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化蛋清溶菌酶的手段。

反胶团萃取法克服了传统提取工艺的复杂性，得率低，蛋白质容易变性的缺点，但是有效的提纯溶菌酶的亲和反胶团现阶段还不是很多，因此在溶菌酶提纯中应用还不是很广泛。

5溶菌酶的改性方法溶菌酶是一种非广谱抗菌剂，一般蛋清溶菌酶对革兰氏阳性菌抑菌效果最显著，因为革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层较厚，而且位于最外层，溶菌酶能够对其进行有效地水解。

已有研究证明其对枯草芽孢杆菌、溶壁微球菌、黄色八叠球菌、地衣型芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、酪丁酸梭菌等有良好的溶菌作用。

但研究证明溶菌酶对革兰氏阴性细菌效果较差，因为革兰氏阴性菌细胞壁中肽聚糖含量很少，而且被一层较厚的脂多糖类物质所覆盖，溶菌酶很难通过外膜而进入革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖层进行水解，从而限制了溶菌酶作为一种天然广谱生物抗菌剂的广泛应用。

近年来，各国科学家通过各种方法对溶菌酶进行改性使其达到对革兰氏阴性菌的抑菌效果。

现在比较广泛使用的是化学改性、生物改性、物理改性等方法。

5.1化学改性酶分子的化学改性，就是在分子水平上对酶进行改造，包括对酶分子主链结构和侧链基团的改变，即在已知酶的结构与功能关系的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状。

研究者猜想，如果在天然溶菌酶上共价结合一种疏水试剂，形成一种两亲蛋白质，就可以使得改性后的溶菌酶穿过脂多糖层，抑制革兰氏阴性菌。

但是在对溶菌酶进行化学修饰使其具有较强的疏水性的同时，也要使修饰溶菌酶仍保留一定的亲水性，只有当修饰酶的两亲性得到很好平衡，才能对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都会有很好的抑制效果。

Andreas 等［14］通过对比试验发现，溶菌酶和咖啡酸以及肉桂酸通过共价结合的改性产物对大肠杆菌的抑制作用比天然溶菌酶更强。

但改性酶的活性略有下降，各种共价物的抑制作用有细微的差别，溶菌酶-咖啡酸共价物对大肠杆菌的抑制作用很强，溶菌酶-肉桂酸共价物对大肠杆菌的抑制效果也很明显，但是略低于前者。

Jill 等［15］研究发现EDTA 与溶菌酶联合使用能够提高溶菌酶对革兰氏阴性菌大肠杆菌和单核细胞增生李斯特菌的抑制效果。

Visa ［16］在30℃，pH 8.0条件下用二硫苏糖醇处理溶菌酶0.5～4h ，结果发现可使修饰酶对革兰氏阴性菌的杀菌效果大大增强。

Zahra 等［17］用葡聚糖硫酸酯对溶菌酶进行修饰改性后，发现改性后的溶菌酶对革兰氏阴性菌也有一定的抑制作用。

Rao 等［18］采用对照试验发现几丁寡糖（COS ）和溶菌酶联合使用对肉类保鲜具有协同效果，二者结合使用对革兰氏阴性菌的杀灭作用大大增强，对肉制品中大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌作用尤其显著。

Shu-tao 等［19］采用短中链的饱和脂肪酸己酸、癸酸和十四酸修饰溶菌酶，结果证明，使用短中链脂肪酸修饰溶菌酶得到的共价物，酶的活性损失较小而且对革兰氏阴性菌的抑菌效果高于长链脂肪酸。

由此可以推断出随着结合的脂肪酸数量的增加，对革兰氏阴性菌的抑菌效果增强，但增加到一定程度后，酶活性和热稳定性会下降，因此控制合适的改性度是成功改性的关键。

5.2生物改性溶菌酶的生物改性是指采用生物技术手段改变溶菌酶的结构，从而改变其理化性质、功能等。

目前对溶菌酶的改性主要是基于溶菌酶的结构特性在溶菌酶上接入一些疏水基团等使其具有一定的疏水性从而能够穿过脂多糖层进入革兰氏阴性菌的肽聚糖层，从而破坏肽聚糖结构，使细胞壁破裂。