高效液相色谱法检验方法

生效日期20140101

负责姓名职位签名/日期

起草何瑞清QC

审核梁天静QC主管

批准张小伶质量部经理

分发部门：

部门份数部门份数QC室1

1 目的

建立高效液相色谱法检验程序

2 范围

本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作

3 职责

3.1QC人员：严格按本程序操作

3.2QC主管：严格按本程序检查

4 内容

4.1 定义及概述

4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一

定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压

输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流

动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪

或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。

由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有

分离性能高，分析速度快的特点。

4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的

药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分

子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反

应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于

正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相

或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合

硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子

交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。

4.1.3 仪器的组成和一般要求：

4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。

4.1.3.2 对仪器的一般要求：

——所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱

的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规

定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅

胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，

辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶

也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色

谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色

谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为

紫外吸收检测器。

——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符

合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。（紫外

分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸

收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不

置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池

所吸收度，在220～240nm范围内不得超过

0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在

251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以

上时不得超过0.05。）

——正文中各品种项下规定的条件除固定相种

类、流动相组分、检测器类型不得任意改变

外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、

载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的

比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均

可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用

性试验的要求。

——仪器各部件应能正常工作，管路为无死体

积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测

器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满

足分析要求。

4.2 操作前的准备：

4.2.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫

外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高

纯水。对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节。配制好

的流动相应通过0.44μm适宜的滤膜滤过，用前脱气。应配制足

量的流动相及时待用。

4.2.2 供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。定量

测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液

在注入色谱仪前，一般应经0.44μm适宜的滤膜滤过。必要时，在

配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。

4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本

次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶

剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适

应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。

4.2.4 系统适用性试验：按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即

用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求，或

规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾

因子。

4.2.5 色谱柱的理论板数（n）在先定的条件下，注入供试品溶液或品

种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或

内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同

单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的

理论板数。如测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板

数，应改变色谱柱的某些条件（如信长、载体性能、色谱柱允填

的优劣等），使理论板数达到要求。

4.2.6 分离度：分量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或

内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：

R =

式中t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间；

t R1为相邻两峰中前一峰的保留时间； t R1 t R2

W1及W2为此相邻两峰的峰宽。 W1 W2

除另有规定外，分离度应大于1.5。

4.2.7 重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定

外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品

种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶

液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进

样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。

4.2.8 拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查

待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓

度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：

T=

式中W0.05h为0.05峰高处的峰宽；

d1为峰极大至W0.005h