高效液相色谱法检验方法

生效日期20140101
负责姓名职位签名/日期
起草何瑞清QC
审核梁天静QC主管
批准张小伶质量部经理
分发部门：
部门份数部门份数QC室1
1 目的
建立高效液相色谱法检验程序
2 范围
本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作
3 职责
3.1QC人员：严格按本程序操作
3.2QC主管：严格按本程序检查
4 内容
4.1 定义及概述
4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一
定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压
输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流
动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪
或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。

由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有
分离性能高，分析速度快的特点。

4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的
药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分
子物质的测定。

有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反
应，方能进行分离或检测。

常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于
正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相
或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合
硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子
交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。

4.1.3 仪器的组成和一般要求：
4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。

4.1.3.2 对仪器的一般要求：
——所用的仪器为高效液相色谱仪。

色谱柱
的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规
定。

常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅
胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，
辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶
也有使用。

离子交换填充剂用于离子交换色
谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色
谱等。

除另有规定外，柱温为室温，检测器为
紫外吸收检测器。

——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符
合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。

（紫外
分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸
收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不
置任何物质），测定其吸收度。

溶剂和吸收池
所吸收度，在220～240nm范围内不得超过
0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在
251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以
上时不得超过0.05。

）
——正文中各品种项下规定的条件除固定相种
类、流动相组分、检测器类型不得任意改变
外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、
载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的
比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均
可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用
性试验的要求。

——仪器各部件应能正常工作，管路为无死体
积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测
器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满
足分析要求。

4.2 操作前的准备：
4.2.1 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫
外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高
纯水。

对规定pH值的流动相，应使用精密pH计进行调节。

配制好
的流动相应通过0.44μm适宜的滤膜滤过，用前脱气。

应配制足
量的流动相及时待用。

4.2.2 供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配制成供试溶液。

定量
测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。

供试溶液
在注入色谱仪前，一般应经0.44μm适宜的滤膜滤过。

必要时，在
配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。

4.2.3 检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本
次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶
剂与现用流动相能否互溶，流动相的pH值与该色谱柱是否相适
应，仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。

4.2.4 系统适用性试验：按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即
用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求，或
规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾
因子。

4.2.5 色谱柱的理论板数（n）在先定的条件下，注入供试品溶液或品
种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或
内标物质峰的保留时间t R（以分钟或长度计，下同，但应取相同
单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54（t R/W h/2）2计算色谱柱的
理论板数。

如测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板
数，应改变色谱柱的某些条件（如信长、载体性能、色谱柱允填
的优劣等），使理论板数达到要求。

4.2.6 分离度：分量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或
内标峰之间有较好的分离度。

分离度（R）的计算公式为：
R =
式中t R2为相邻两峰中后一峰的保留时间；
t R1为相邻两峰中前一峰的保留时间； t R1 t R2
W1及W2为此相邻两峰的峰宽。

W1 W2
除另有规定外，分离度应大于1.5。

4.2.7 重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定
外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。

也可按各品
种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶
液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进
样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。

4.2.8 拖尾因子：为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查
待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓
度进样的校正因子误差是否符合要求。

拖尾因子计算公式为：
T=
式中W0.05h为0.05峰高处的峰宽；
d1为峰极大至W0.005h
峰前沿之间的距离。

d1 除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。

4.3 测定方法：
定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法成峰高法。

测定杂质含量时，须
采用峰面积法。

4.3.1 内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量：
4.3.1.1 测定方法：按各品种项下的规定，精密称（量）取对照
品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成
校正因子测定用的对照溶液。

取一定量注入仪器，记录
色谱图。

测量对照品和内标物质的峰面积或峰高。

4.3.1.2 按下式计算校正因子：
校正因子（f）=
式中：As为内标物质的峰面积或峰高；
A R为对照品的峰面积或峰高；
Cs为内标物质的浓度；
C R为对照品的浓度。

4.3.1.3 含量测定：再取各品种项下含有内标物质的供试品溶
液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分
（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算
含量：
含量（Ｃx）＝
式中Ax为供试品（或杂质）峰面积或峰高；
Ｃx为供试品（或杂质）的浓度；
f、As和Cs的意义同（3.7.1.2公式）
4.3.1.4 称量要求：当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内
标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配
制内标物质溶液不必精密称（量）取。

4.3.2 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量：
4.3.2.1 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品的供度品，
配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱
图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高）。

4.3.2.2 按下式计算含量：
含量（C X）=
式中符合意义：C X为供试品（或其杂质）的浓度：
mg/ml；
A X为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；
C R为对照品的浓度：mg/ml；
A R为对照品的峰面积或峰高。

4.3.3 加校正因子的主成分自身对照法：
4.3.3.1 测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分身身对照
法。

在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称
（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测
定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述
3.7.1法计算杂质的校正因子。

此校正固子可直接载入各
品种正文中，用于校正杂质的实则峰面积。

4.3.3.2 测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供
试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，
进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受可限）或进
样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱
峰高约达满量程的10%~25%或其峰面积能准确积分（面
积约为通常条件下满量程峰积分值的10%）。

然后，取
供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液
的记录时间除另有规定外，应为主成成保留时间的若干
倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘
以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，
依法计算各杂质含量。

4.3.4 不加校正因子的主成分自身对照法：
4.3.4.1 当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身
对照法。

同上述配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供
试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间除
另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品
溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰
面积比较，计杂质含量。

4.7.4.2 若供试品所含的部分杂质未与溶液峰完全分离，则按规
定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂
的色谱图Ⅱ。

色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂
峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的
校正面积。

然后依法计算。

4.3.5 面积归一化法：
4.3.
5.1 由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能
用于粗略考察供试品中的杂质含量。

除另有规定外，一
般不宜用于微量杂质的检查。

方法是测量各杂质峰的面
积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰
面积占总峰面积的百分率，即得。

4.3.
5.2 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测
定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为
好。

4.4 色谱数据的收集和处理：
4.4.1 注样的同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如采
用记录仪，则注样同时按一下记号键，作起始记号。

4.4.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。

4.4.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整各有关参数，使色谱峰信
号在色谱图上有一定强度。

4.4.4 含量测定的对照溶液和样品供试液每份至少注样2次，由全部注
样结果（n≥4）求得平均值，相对标准偏差（RSD）应不大于
1.5%。

4.5 注意事项：
4.5.1 色谱柱与进样器及其出品端与检测器之间应无死体积连接，以
免试样扩散影响分离。

4.5.2 新柱或被污染柱用适当溶剂冲洗时，应将其出口端与检测器脱开，避免污染。

4.5.3 压力表无压力显示或压力波动时不能进行分析，应检查泵中气
泡是否已排除，各连接处有无漏液，排除故障后方能进行操
作。

如压力升高，甚至自动停泵，应检查柱端有无污染堵塞，
可小心卸开柱的进口端螺帽，挖出被污染填冲剂后，补入同类
填充剂，仔细安装好，再进行操作。

4.5.4 发现记录基线波动，出现毛刺等现象，首先应检查检测器流通
池中是否有气泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘灯稳
定，同时检查仪器的接地是否良好，必要时换上新的氘灯。

仪
器稳定后方能进行操作。

4.5.5 进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡，如系统适用性并不
符合规定，或填充剂已损坏，则应更换新的同类色谱柱进行分
析，由于同类填充剂的化学键合相的键合度及性能等存在一定
差异，往往依法操作达不到预定的分离时，可更换另一牌号的
同类色谱柱进行试验。

4.5.6 以硅胶作载体的化学键合相填充剂的稳定性受流动相pH值的影
响，使用时，应详细参阅说明书，在规定的pH值范围内选用流
动相，一般pH范围为（2.4—7.4）。

使用高pH值流动相时，可
在泵与进样器之间连接一硅胶短柱，以饱和流动相，保护分析
柱，并尽可能缩短在高pH值下的使用时间，用后立即冲洗。

4.5.7 各色谱柱的使用应登记，以方便选择和更新。

4.5.8 色谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱到检测器流通池，在分
析完毕后，均应充分冲洗，特别是用过含盐流动相的，更注意
先用水，再用甲醇—水，充分冲洗。

如发现泵漏液等较严重的
情况，应请有经验的维修人员进行检查、维修。

5参考和相关文件
中国药典2010版附录
6附录
无
7历史记录
版本生效日期变更综述
12014.01.01新订
－完－。