高效液相色谱法分离实验

高效液相色谱实验

高乃群

实验目的：1 进一步理解高效液相色谱的基本原理；

2 熟悉高效液相色谱仪器的构成；

3 了解影响高效液相色谱分离的主要操作参数。

实验原理：

1. 基本原理

在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配，这种分配过程即为色谱过程。由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱分析法的实质。也就是说，当一种不与被分析物质发生化学反应的被称为载气的永久性气体（例如H2、N2 、He、 Ar 、CO2等）携带样品中各组分通过装有固定相的色谱柱时，由于试样分子与固定相分子间发生吸附、溶解、结合或离子交换，使试样分子随载气在两相之间反复多次分配，使那些分配系数只有微小差别的组分发生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离，例如一个试样中含A、B二个组分，已知B组分在固定相中的分配系数大于A，即K B > K A，如图1-1所示。

当样品进入色谱柱时，组分A、B以一条混合谱带出现，由于组分B 在固定相中的溶解能力比A大，因此组分A的移动速度大于B，经过多次反复分配后，分配系数较小的组分A首先被带出色谱柱，而分配系数较大的组分B则迟被带出色谱柱，于是样品中各组分达到分离的目的。设法将流出色谱柱某组分的浓度变化用电压、电流信号记录下来，便可逐一进行定性和定量分析。

2.高效液相色谱法的分类及其分离原理

液-固色谱法液—液色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法a.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）

固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其

表面常存在分散的吸附中心点。流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相)

其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。

吸附反应的平衡常数K为：

K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。

K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

②液-固色谱法的吸附剂和流动相

常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。对流动相的基本要求：试样要能够溶于流动相中流动相粘度较小流动相不能影响试样的检测

常用的流动相：甲醇、乙腈、水等。

b.液-液色谱法（液-液分配色谱法）

将液体固定液涂渍在担体上作为固定相

①液-液色谱法的作用机制

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

②正相色谱和反相色谱

正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)

作流动相；反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

③液-液色谱法的固定相

常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈(ODPN)，非极性的十八烷(ODS)和异二十烷(SQ)等。

①凝胶色谱法的作用机制：体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流

动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法。

②凝胶色谱法的固定相：

软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。

实验设备：高效液相色谱仪

仪器及试剂：邻硝基苯酚间苯三酚注射器

实验步骤及数据处理：

1.实验前提前打开仪器进行平衡；

2.将待测样品脱气及过滤处理；

3.本实验用邻硝基苯酚和间苯三酚不同浓度的混合液做标准曲线得

到的标准曲线图如下：

4.根据标准曲线进行定性实验测得第一个峰为间苯三酚，第二峰为

邻硝基苯酚；

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用户名称： S y s te m

项目名称： S S 学生实验

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2008-12-16

样品信息

样品名称：采集者： S y s te m

样品 样品类型：采集时间： 未知 2008-12-16 15:10:51 瓶号：采集方法组： 1 s s 学生实验

进样次数：处理日期： 7

2008-12-16 15:50:02 进样体积：处理方法： 20.00 u l te s t08 运行时间：通道名称： 10.0 M in u te s

S a tin C h 2

样品组名称：

处理通道注释：

流动相 甲醇 波长254n m 流速 0.5m l/m in

自动标尺色谱图

M

v

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分钟

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间苯

三酚 -

4.558邻硝基

苯酚

- 5.51012

名字保留时间

(分钟)

面积(微伏*秒)高度(微伏)含量单位间苯三酚邻硝基苯酚

4.558

5.510

29553684654192

339060478157

0.0600.065

m g /m l m g /m l

色谱峰结果