第14章 全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪教学指导

第十四章全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序

仪

首页基本要求重点难点讲授学时内容提要

1．基本要求

1.1了解

(1)全自动DNA测序仪的仪器结构

(2)全自动DNA测序仪各组成部分的功能

(3)全自动DNA测序仪的进展

(4)蛋白质测序仪的结构及其各部件的功能

(5)蛋白质测序仪的主要应用

1.2 熟悉

(1)荧光标记DNA的检测原理

(2)全自动DNA测序仪的常见故障及维护

(3)全自动DNA测序仪的主要应用

1.3 掌握

(1)双脱氧链末端终止法测序原理

(2)荧光标记引物法定义及特点

(3)荧光标记终止底物法定义及特点

(4)荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点

(5)蛋白质测序仪的工作原理

2．重点难点

2.1重点

(1)双脱氧链末端终止法测序原理

(2)荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的定义及两者的异同点

(3)蛋白质测序仪的工作原理

2.2 难点

(1)荧光标记DNA的检测原理

(2)全自动DNA测序仪的结构及仪器各组成部分的功能

(3)全自动DNA测序仪的常见故障及维护

3．讲授学时

建议2学时~4学时

4．内容提要

4.1全自动DNA测序仪

4.1.1 全自动DNA测序仪的工作原理

DNA测序是指检测其一级结构--核苷酸的线性排列顺序。目前DNA测序仪的工作原理主要是利用Sanger双脱氧链末端终止法或Maxam-Gilbert化学降解法。

双脱氧链末端终止法测序原理：

是利用DNA的体外合成过程－聚合酶链反应（PCR）。反应体系中除加入4种dNTP外，还加入一种2'，3'-双脱氧核苷三磷酸（2',3'-ddNTP，N代表A、C、G、T任一碱基）。与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的3'位置上缺少一个羟基，反应过程中虽然可以与正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖3'-OH发生反应，形成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但它们本身没有3'-OH，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同的DNA 模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对长度不等的新生链进行分离后，就可根据片段大小直接读出新生DNA链的序列。

新生链的荧光标记：

(1)多色荧光标记法多色荧光标记法的荧光染料掺入方式有两种。第一种方式是将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5'端，称为荧光标记引物法。第二种掺入方式是将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上，称为荧光标记终止底物法。

●表示5’端带有不同荧光染料的引物、、、表示

标记不同颜色荧光染料的ddNTP

图18-1 荧光标记引物法化学原理图18-2 荧光标记终止底物法化学原理

此两种方法都确定了4种荧光染料与4种双脱氧核苷酸所终止的DNA片段之间的专一对应关系。两种掺入方式的区别在于，荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的5 端，可以理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔。而荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成。在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成。

(3) 单色荧光标记法也包括荧光标记引物法和荧光标记终止底物法两种。与多色荧光标记法不同的是单色荧光标记引物法和荧光标记终止底物法均需将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳。

荧光标记DNA的检测原理：

测序反应产物加入测序仪后，两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶高分子聚合物中从负极向正极泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口。由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被导向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA片段。DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光。这种代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。经计算机软件分析后显示测序结果。整个电泳过程结束时在检测区某一点上采集的所有荧光信号就转化为一个以时间为横轴坐标，荧光波长种类和强度为纵轴的信号数

据的集合。经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来。

4.1.2 全自动DNA测序仪的结构与功能

目前使用的全自动DNA测序仪都是通过凝胶电泳技术进行DNA片段的分离。根据电泳方式的不同又分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型。平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶电泳。毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50μm～100μm），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离。

不同类型全自动DNA测序仪的外观有所差异，但基本结构大致相同，主要由主机、微型计算机和各种应用软件等组成。

主机主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统等。大致可分为以下几个结构功能区：

(1)自动进样器区装载有样品盘、电极（负极）、电极缓冲液瓶、洗涤液（蒸馏水）瓶和废液管。

(2)凝胶块区凝胶块区包括注射器驱动杆、样品盘按钮、注射器固定平台、电极（正极）、缓冲液

阀、玻璃注射器、毛细管固定螺母和废液阀等部件。

(3)检测区检测区内有激光检测器窗口及窗盖、加热板、毛细管、热敏胶带。

仪器各组成部分的功能

(1)主机功能主机具有自动灌胶、进样、电泳、荧光检测等功能。

自动进样器区功能①自动进样器受程序控制进行三维移动，许多操作如毛细管进入样品盘标本孔中进样、电极和毛细管在电极缓冲液瓶、洗涤液和废液管中移动等均依靠自动进样器的移动完成；②电极为电泳的负性电极，测序过程中，正、负极之间的电势差可达15000伏，如此高的电势差可促进DNA 分子在毛细管中很快泳动，达到快速分离不同长度DNA片段的目的；③样品盘有48孔和96孔两种，可一次性连续测试48或96个样本；④电极固定螺母起固定电极及毛细管的作用。

凝胶块区功能①注射器驱动杆：给注射器提供正压力，将注射器内的凝胶注入毛细管中；②样品盘按钮：控制自动进样器进出；③注射器固定平台：起固定注射器的作用；④电极：为电泳的正性电极，始终浸泡在正极缓冲液中；⑤正极缓冲液阀：当注射器驱动杆下移，将注射器内的凝胶压入毛细管时，缓冲液阀关闭，以防止胶进入缓冲液；电泳时此阀打开，提供电流通道；⑥玻璃注射器：储存凝胶高分子聚合物以及在填充毛细管时提供必要的压力；⑦毛细管固定螺母：固定毛细管；⑧废液阀：在清洗泵块时控制废液流。

检测区功能①激光检测器窗口及窗盖：从仪器内部的氩离子激光器发出的激光可通过激光检测器窗口照到毛细管检测窗口上。电泳过程中，当荧光标记DNA链上的荧光基团通过毛细管窗口时，受到激光的激发而产生特征性的荧光光谱，荧光经分光光栅分光后投射到CCD摄像机上同步成像。窗盖起固定