Solexa-测序技术原理介绍_20120715
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• 如何读到DNA片段的碱基信号？
–通过扩增来增加DNA的数量来放大信号 –有足够多的DNA合成反应中止于同一个碱基
• 如何读到DNA片段的连续碱基信号？
–让合成反应的中止依次出现在每个碱基上
• 如何读到一批DNA片段的连续碱基信号？
–在不同模板的反应间建立有效的隔离方式
Contents
• Sanger 测序技术原理
OH
OH
diol diol
Cluster 扩增完成
OH
线性化
OH
用ddNTP () 阻断
Primer 加测序引物
Paired-End Sequencing
Paired-End Sequencing
(PE, 双向测序)是指检 测基因片段的两端序列 信息。
Flocell接头 SE vs PE
Single Read
基于平板胶的测序技术
96通道毛细管阵列
双脱氧终止法测序反应原理
• 原理：
–原料：DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、 4种dNTP及 4种ddNTP的测序反应体系
脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸
双脱氧终止法测序反应原理
• 测序过程：
–DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引 物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的 DNA链。
测序技术原理及流程
北京百迈客生物科技有限公司
Why Sequencing？
• 认识DNA序列 • 从根源上寻找导致蛋白功能差别的位点 • 为物种鉴定、临床诊断和司法鉴定提供基
础 • 疾病预测 • 研究基因间的相互作用 • 揭示物种进化的历程 • 生命之树
一代 测序
二代 测序
DNA测序需要解决的基本问题
Sanger法的特点
• 原始输出是峰图文件，可以看出信号的细微变化 • 通量小 • 单个目标序列的处理灵活性强 • 系统稳定，操作简便 • 单个测序长度长，能达到上K
• 反应单元是一个充满溶液的容器（96孔板或384孔 板的一个孔），这是局限了通量的根本
Next-generation sequencing technology
双向测序
Single-Read Sequencing
Single-Read Sequencing(SR, 单向测序)指只检测基因
片段一端的序列信息。
互补接头 接头
基因序列
接头
序列片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
OH
Resynthesis of P5 Strand
合成
Sequencing Second Read
第二端测序
Primer 加测序引物
Block with ddNTPs 阻断
OH
P7 Linearization (fpg) 线性化
• Solexa（Illumina GA/HiSeq） 测序技术原理 • 454 测序技术原理 • SOLiD 测序技术原理
• 四种测序方法比较
the first-generation sequencing technology
Sanger法测序原理
Sanger测序技术
PCR末端终止技术+电泳检测技术 单个片段序列测定 最高通量：小于4MB/天
–在链的延长过程中一旦加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）， 由于其双脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续 的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。形成一系列具有相 同5’-引物端和以ddNTP残基为3’端结尾的长短不一的片 段的混合物，通过毛细管电泳，并经过分析从而获得模板 DNA的核苷酸序列。
Solexa测序原理及流程介绍
solexa测序技术原理
Solexa 是 一 种 基 于 边 合 成 边 测 序 技 术 (Sequencing-By-
Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实 现在小型芯片(Flow Cell)上进行PCR反应。
新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记
T
T G C
T A C G A
T A C C C G A
T C G A
T
5’
Sequencing
123456 789
TGCTACGAT…
Image acquisition
Base calling
solexa 测序策略
Single-Read Sequencing
单向测序
Paired-End Sequencing
1st cycle annealing
退火
n=25 total
U
U
1st cycle extension
延长
U
U
2nd cycle denaturation
再变性
U
U
U
2nd cycle extension
延长
U
U
U
2nd cycle annealing
退火
Cluster 过程结束
U
U
Cluster Amplification 扩增后的簇
荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光， 从而读取碱基信息。
Solexa Sequencing Technolog3’ 5y’
DNA (0.1-1.0 ug)
Sample preparation
SinCglluesmteor lgercouwletharray
AG C
A T
C G
A T CG
变性
扩增
diol diol
1st cycle 变性
diol diol
1st cycle 退火
n=35 总数
diol diol
1st cycle 延长
diol diol
2nd cycle 变性
diol
diol diol
2nd cycle 延长
diol
diol diol
2nd cycle 退火
Cluster 过程结束
P5 Linearization (USER) 线性化
Block with ddNTPs 阻断
Primer 加测序引物
双向测序
SBS 进行测序
Sequencing First Read 第一端测序
OH OH
Denaturation and De-Phosphorylation
(PNK) 变性与去磷酸化
Paired End
片段杂交
OH OH
U
P7 Leabharlann Baidu5
Grafted flowcell
芯片上的接头
U
U
Template Hybridization
模板杂交
U
U
Initial extension
第一链的延长
U
U
Denaturation
变性
扩增成簇
U
U
1st cycle denaturation
变性
U
U
–通过扩增来增加DNA的数量来放大信号 –有足够多的DNA合成反应中止于同一个碱基
• 如何读到DNA片段的连续碱基信号？
–让合成反应的中止依次出现在每个碱基上
• 如何读到一批DNA片段的连续碱基信号？
–在不同模板的反应间建立有效的隔离方式
Contents
• Sanger 测序技术原理
OH
OH
diol diol
Cluster 扩增完成
OH
线性化
OH
用ddNTP () 阻断
Primer 加测序引物
Paired-End Sequencing
Paired-End Sequencing
(PE, 双向测序)是指检 测基因片段的两端序列 信息。
Flocell接头 SE vs PE
Single Read
基于平板胶的测序技术
96通道毛细管阵列
双脱氧终止法测序反应原理
• 原理：
–原料：DNA聚合酶、DNA模板、单链寡核苷酸引物、 4种dNTP及 4种ddNTP的测序反应体系
脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸
双脱氧终止法测序反应原理
• 测序过程：
–DNA聚合酶在模板链指导下，不断地逐个将dNTP加到引 物的3’-OH末端，使引物延伸，合成出新的与模板互补的 DNA链。
测序技术原理及流程
北京百迈客生物科技有限公司
Why Sequencing？
• 认识DNA序列 • 从根源上寻找导致蛋白功能差别的位点 • 为物种鉴定、临床诊断和司法鉴定提供基
础 • 疾病预测 • 研究基因间的相互作用 • 揭示物种进化的历程 • 生命之树
一代 测序
二代 测序
DNA测序需要解决的基本问题
Sanger法的特点
• 原始输出是峰图文件，可以看出信号的细微变化 • 通量小 • 单个目标序列的处理灵活性强 • 系统稳定，操作简便 • 单个测序长度长，能达到上K
• 反应单元是一个充满溶液的容器（96孔板或384孔 板的一个孔），这是局限了通量的根本
Next-generation sequencing technology
双向测序
Single-Read Sequencing
Single-Read Sequencing(SR, 单向测序)指只检测基因
片段一端的序列信息。
互补接头 接头
基因序列
接头
序列片段杂交
OH
diol
P7 P5
Flow Cell接头
diol diol
模板杂交
diol diol
延长
diol diol
OH
Resynthesis of P5 Strand
合成
Sequencing Second Read
第二端测序
Primer 加测序引物
Block with ddNTPs 阻断
OH
P7 Linearization (fpg) 线性化
• Solexa（Illumina GA/HiSeq） 测序技术原理 • 454 测序技术原理 • SOLiD 测序技术原理
• 四种测序方法比较
the first-generation sequencing technology
Sanger法测序原理
Sanger测序技术
PCR末端终止技术+电泳检测技术 单个片段序列测定 最高通量：小于4MB/天
–在链的延长过程中一旦加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）， 由于其双脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能同后续 的dNTP形成磷酸二酯键，链终止延伸。形成一系列具有相 同5’-引物端和以ddNTP残基为3’端结尾的长短不一的片 段的混合物，通过毛细管电泳，并经过分析从而获得模板 DNA的核苷酸序列。
Solexa测序原理及流程介绍
solexa测序技术原理
Solexa 是 一 种 基 于 边 合 成 边 测 序 技 术 (Sequencing-By-
Synthesis，SBS)的新型测序方法。通过利用单分子阵列实 现在小型芯片(Flow Cell)上进行PCR反应。
新的可逆阻断技术可以实现每次只合成一个碱基，并标记
T
T G C
T A C G A
T A C C C G A
T C G A
T
5’
Sequencing
123456 789
TGCTACGAT…
Image acquisition
Base calling
solexa 测序策略
Single-Read Sequencing
单向测序
Paired-End Sequencing
1st cycle annealing
退火
n=25 total
U
U
1st cycle extension
延长
U
U
2nd cycle denaturation
再变性
U
U
U
2nd cycle extension
延长
U
U
U
2nd cycle annealing
退火
Cluster 过程结束
U
U
Cluster Amplification 扩增后的簇
荧光基团，再利用相应的激光激发荧光基团，捕获激发光， 从而读取碱基信息。
Solexa Sequencing Technolog3’ 5y’
DNA (0.1-1.0 ug)
Sample preparation
SinCglluesmteor lgercouwletharray
AG C
A T
C G
A T CG
变性
扩增
diol diol
1st cycle 变性
diol diol
1st cycle 退火
n=35 总数
diol diol
1st cycle 延长
diol diol
2nd cycle 变性
diol
diol diol
2nd cycle 延长
diol
diol diol
2nd cycle 退火
Cluster 过程结束
P5 Linearization (USER) 线性化
Block with ddNTPs 阻断
Primer 加测序引物
双向测序
SBS 进行测序
Sequencing First Read 第一端测序
OH OH
Denaturation and De-Phosphorylation
(PNK) 变性与去磷酸化
Paired End
片段杂交
OH OH
U
P7 Leabharlann Baidu5
Grafted flowcell
芯片上的接头
U
U
Template Hybridization
模板杂交
U
U
Initial extension
第一链的延长
U
U
Denaturation
变性
扩增成簇
U
U
1st cycle denaturation
变性
U
U