实验二 动物细胞培养液的配制与灭菌1

。
2、 配制100ml DMEM培养基
（1） 烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水;
（2）准确称量药品DMEM 1.17g，
（3）准确称量药品NaHCO3 0.37g;
（4）准确称量药品谷胺酰胺0.003g； （5）准确称量药品HEPES（乙基哌嗪乙硫磺酸） 0.5958g, 依次放入烧杯;加入青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml. （6）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解; （7）调节PH值使之约为7.2; （8） 定容；（9） 过滤灭菌；（10）分装保存。
生素
超净台
温度：36～37 pH : 7.2~7.4
温度 和pH
气体 环境
95%空气和5%CO2
2、常用细胞培养用液：
• 水
• 培养基：天然培养基、合成培养基、无血清培养基
• 生理盐液：PBS
• 消化用液：胰蛋白酶
• 抗生素液：青链霉素
3、常用的灭菌方式： • 紫外线消毒: 紫外线是一种低能量的电磁辐射，
可杀死多种微生物。紫外线的直接作用是通过破 坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作
用是通过紫外线照射分解空气中的氧气形成臭氧
杀死微生物。
• 蒸汽湿热灭菌法：
• 是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽
以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透
力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。
• 湿热灭菌法一般采用121℃，灭菌20-30min。
3、PBS的高压灭菌
高压灭菌锅，120℃，15分钟
2013-2014-1遗传学实验
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4、DMEM培养基滤器灭菌
（1）将塑料环放在上盖与下底之间，锁紧。用双层牛皮纸 包好高压蒸汽灭菌。 （2）选一个适当的容器，如锥形瓶﹑试管﹑窄口瓶等亦高 压蒸汽灭菌。 （3）将微孔滤膜用平头镊子夹住，放在微孔滤膜装置中一 起高压蒸汽灭菌。 （4）将需要灭菌的实验器材溶液配置好。
（5）将无菌的微孔滤膜装置由下底口套在无菌的容器上。用塑
料注射筒吸取要灭菌的溶液。
（6）注射筒口插入微孔滤膜过滤装置之上盖口。 挤压注射筒
的推管，使溶液流经微孔滤膜流入无菌容器中。
（7）移去微孔滤膜，将容器口通过酒精灯火焰，盖上盖子标上 溶液名称及日期。 （8）拆开微孔滤膜装置，将微孔滤膜丢掉（或灭菌后丢弃）， 其它装置清洗干净。
• 温度适宜；溶解氧、pH和气体环境
• 各类营养成分：糖（能量）、氨基酸（合成蛋白质的原料
）、维生素（细胞内酶的辅酶或辅基）、生长因子（激素
类等促进细胞增殖） • 渗透压 • 附着物（贴壁生长）等
无机盐、微量元 素、葡萄糖、氨 基酸、促生长因 细 子等
培养基中加入抗
胞 培 养 的 条 件
营养
无菌 பைடு நூலகம்毒 环境
本次实验的任务
• 每组配制1LPBS 生理盐液，并包好瓶口；
• 每组仔细清洗5-6个培养皿和细胞培养瓶（
保证每人一个），分别一起包好；
注意事项
1、注意高压灭菌锅的安全使用。
2、注意滤器灭菌时的滤膜完整性。
3、配制溶液时药品要准确称量
4、勿浪费药品试剂
五、思考题
1、灭菌方式的选择分析
2、 为什么进行细胞培养时培养液中需要加入
NaOH，NaHCO3，DMEM， 蒸馏水，双蒸水
四、实验内容
1、配制PBS
（1）烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水; （2）准确称量药品，依次放入烧杯; （3）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解; （4）调节PH值使之约为7.2; （5）定容；（6）高压灭菌,120℃ 15分钟；（7） 分装保存
• 高温干热灭菌法：恒温干燥箱， 120ºC～150ºC
的高热。果蝇培养瓶、玻璃试剂瓶等。
• 过滤除菌：是将液体或气体通过有微孔的滤膜
过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留
，从而达到除菌的方法。培养基等的灭菌。
• 化学消毒法：仅限于表面的消毒。用于不能用物理方
法进行消毒的物品、空气、工作面、操作者皮肤以及某些
实验器皿等。
• 酒精
• 甲醛
• 高锰酸钾
• 抗生素：用于培养液，是培养过程中预防微生物污染
的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施
三、实验仪器与材料
• 仪器：玻璃杯，玻璃棒，电子天平，量筒，
PH试纸，试剂瓶等
• 试剂：NaCl, KCl, Na2HPO4· 12H2O，KH2PO4，HCl,
细胞生物学与细胞工程实验的总体安排 （10-18周）
• 实验一 显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验 • 实验二 动物细胞培养液的配制与灭菌 • 实验三 动物细胞的组织块培养法
• 实验四 动物组织的消化及细胞冻存
• 实验五 细胞复苏及活力测定 • 实验六 细胞骨架的光镜观察 • 实验七 小鼠骨髓细胞染色体玻片标本的制作 • 实验八 细胞融合
一定量的小牛血清？
3、 如何确认你所配制的培养基没有被细菌污 染？
• 实验九 血涂片的制备及细胞大小的测量
一、实验目的与要求
• 了解动物细胞培养对条件设施的要求； • 掌握动物细胞培养用液的种类及作用； • 学习各种动物细胞培养用液的配制方法及 灭菌方法。
二、实验原理
1、细胞培养的基本条件：
• 无污染环境（无毒、无菌）：无菌培养室（更衣间、缓冲 间、操作间）、新洁尔灭擦拭地面、超净工作台