药物高通量筛选的设计与实施

关键词]：高通量筛选,设计,实施,综述

健康网讯：

利用计算机模拟技术、组合化学及高通量筛选技术发现新药的研发模式，带动了新药发现技术方法的重要变革。高通量筛选（high throughput screening, FITS)又称大规模集群式筛选，是由一些有特定靶点的微量生物筛选方法、自动化／机器人技术和完整数据处理技术有机组合而成，是一种新型的、高自动化、高灵敏度、高通量的筛选发现新药的技术。目前，世界上大型制药企业都无一例外地将其作为驱动新药发现的强力引擎，纷纷引进新药研发领域，使FITS的形式和内容不断丰富发展，并日益呈现出向超高通量筛选发展的趋势。

1 HTS系统的组成

1.1 高容量的样品库系统高容量的样品库及其数据库管理系统是开展HTS的先决条件。它们可以是生物样品（包括植物、动物和微生物的样品）、从生物样品中提取的活性部位或单体化合物以及人工合成（传统化学合成、组合化学合成）的化合物，化合物数量越多，结构多样性越高，筛选的命中率也越高。

1.2 自动化的操作系统自动化操作系统利用计算机，通过操作软件控制整个筛选过程，一般包括计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心设备及堆栈4个部分，也可以选取不同的组合应用。

1.3 高灵敏度检测系统 HTS检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪以及闪烁亲和分析( scintillation proximity assay，SPA)等检测方法。检测灵敏度越高，则所需的样品量越少，效果越好。

1.4 高特异性的药物筛选系统 HTS常用的筛选模型都是建立在分子水平和细胞水平上，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的作用机制。常用的筛选模型可分为受体结合分析法、细胞因子测定法、细胞活性测定法、代谢物质测定法以及基因产物

测定法等。目前，这些模型主要集中在受体、酶、通道以及各种细胞反应等方面。近年来，基因水平筛选模型可在蛋白质芯片、基因芯片上进行，使筛选模型更加多样化。

1.5 高效的数据处理系统 HTS对数以万计的样品进行多模型的筛选，数据量庞大，与此相适应的数据库管理系统主要承担样品库管理、生物活性信息管理、HTS服务、药物设计与药物发现功能。它以生物活性数据的加工和处理为主体，综合利用化合物的结构信息资源，可以更好地设计药物，加快药物的发现进程。由于FITS采用高度自动化的操作系统，采用分子、细胞水平的生物活性检测模型，借助高灵敏度的检测仪器对化合物的生物活性进行检测。其优势在于样品（包括化合物以及生物样品）可在微孔板上进行，反应体积仅有几微升到数百微升，样品消耗量小。由于广泛使用基因表达的酶、受体、信号传导因子等，筛选的特异性较高。由于应用自动化系统，每天可对数十以至数百块微孔板进行操作，对数千乃至数万的样品进行检测筛选。另外，归纳化合物的活性数据，得出构效关系，可为药物发现提供极有价值的信息。

2 HTS的设计与实施

HTS是从药物作用靶点到活性化合物发现过程，是药物发现系统工程的重要子系统之一。在此过程中，适当安排筛选靶点和测试方法对于建立生物学相关和优质高效的筛选体系至关重要。试剂的供应往往是HTS的瓶颈，必须合理安排试剂部门和筛选部门之间的工作，确保筛选体系充分高效运转。目前，为加快筛选的进度， HTS实验室正逐步采用类似工业化的供应链体系进行管理。总之，HTS系统的实施涉及众多学科，影响因素众多，需要集合包括工程技术、生物学、生物化学、信息技术(IT)、化学等领域专家的智力。以下是在HTS 设计和实施中，应特别重视的因素。

2.1 作用靶点的选择在选择治疗靶点时，首先应该重点确定靶点与疾病的相关性，但也应重视其他影响HTS体系的重要因素，主要包括技术和化学方面的因素。在技术上应该简洁、

高效，化学上则应考虑样品对特定靶点产生的治疗相关效应能否重现在筛选体系中，此效应能否通过筛选被发现，以及是否具有适合作为药物开发的理化性质。

目前，虽然可用于HTS的靶基因和靶标非常有限，但据推算，人类基因组中存在3000～10000 个药物的靶点可供疾病治疗开发。HTS实践表明，某些作用靶点化学的可行性更高，如G蛋白偶联受体(GPCRs)、激酶、离子通道、核受体、蛋白酶等。其中，GPCRs和激酶尤其引人注目HTS筛选命中率较高。对于通过蛋白质之间相互作用而发挥效应的靶点，往往难以被HTS成功应用。原因之一在于样品库中的化合物往往不具备足够大的分子体积和结构复杂性，以阻断巨大的发生在靶点上的蛋白质-蛋白质相互作用面。天然产物由于分子较大，结构复杂，易于做到这一点。对于此类受体而言，找到具有令人满意的阻断效应和接近药物属性（如分子量不要太大）的化合物难度很大。最近，有的国外实验室首先筛选出具有阻断作用的小片段，然后再将这些片段拼接起来，以产生具有适度大小的有效阻断剂。其次，选择作用靶点时，另外一个同等重要的因素是建立高效、优质的筛选体系在技术上的可行性。当然，由于新测试技术的不断涌现，许多新的测试方法已经能够适应多种类型靶点测试的要求。尽管如此，一些类型靶点技术上的可行性仍然很低。技术上容易实现的靶点有GPCRs、激酶、蛋白酶、细胞核受体以及蛋白质-蛋白质相互作用类型的靶点，离子通道类型靶点则相对较难实现。除了激酶和蛋白酶，其他类型的酶的筛选体系必须因底物性质差异而做出适宜的选择。

对于HTS体系而言，获得充足的试剂是一个需要审慎考虑的重要因素，此项工作费钱、费力，且结果难以预料。对于蛋白质靶点而言，往往依赖于特定蛋白质表达和纯化的难易程度，每次筛选需要的蛋白质量，以及底物、配体或者消耗品的价格。所有这些因素必须在筛选体系建立之初就应该审慎考虑，认真评估，因筛选体系的差异而有所制宜。理想的作用靶点应该是化学可行性强、技术上简便、价格低廉、充分有效和高度的生物相关性，这样的靶点少而又少，但应该努力分散化解风险，均衡可用的资源。

2.2 测试方法的选择

2.2.1 生物化学的检测方法目前，大多数的生物化学筛选都采用均质“混合一读取（m ix-and-read）”形式。这些技术包括SPA、荧光增强(fluorescence intensify, FLINT)、荧光极化(fluorescence polari- zation，FP)、荧光共振能量转移（fluorescence reson - ance energy transfer，FRET)技术、时间分辨能量转移（time-resolved energy trans fer，TRET）等。

在生物化学检测分析中，最常用的检测方法都是基于包括闪烁、荧光、吸收、发光等性质的光学方法。其中，基于荧光的检测方法因具有灵敏度高、易于微型化以及适应均质化的特点，是最为重要的检测分析方法之一。建立基于荧光的测试方法应该审慎考虑波长，一般来说应该避免采用短的激发波长（特别是＜400nm)，以减少被测试化合物带来的干扰。

尽管FLINT已经成功地应用于HTS,由于缺少适宜的荧光底物，这种形式的检测仅仅用于少数的酶靶点测试。目前，见诸报道的有多种形式的检测方法。如将FP用于1536孔板中的配体一配体结合反应以及酶测试。TRET是建立在镧系(Ln3+）复合物与适宜的能量共振受体之间大幅度能量转移基础上的双标签检测方法，它可以降低背景干扰，具有较高的灵敏度，特别适用于蛋白质-蛋白质之间的相互作用检测，被越来越多的HTS体系采用。目前，HTS 已开始应用基于单分子振动荧光光谱分析方法，如荧光相关谱(fluorescence correlation spectroscopy,FCS )和荧光强度分配分析技术（fluorescence intensity distribution a nalysis， FIDA)，这些测试方法所需测试体积极小(1到数个 fL)。其他重要的放射分析技术如SPA/Leadseek- erTM和闪烁板(F1ashPlate TM)等应用日益广泛，已用于激酶、核酸处理酶、配体-受体相互作用和cAMP 水平的检测。基于荧光的分析技术也存在诸如安全性、要求试剂稳定性较高、读取时间长以及在同位素环境中特异性差等缺点，映像板读取器(imag ing plate reader)的出现可以解决读取时间和测试微型化的难题。

2.2.2 基于细胞的检测方法 20世纪90年代中期以前，大多数的基于细胞分析检测技术尚不能适应HTS的要求。然而，随着技术的不断进步，筛选通量日益增大，基于细胞的测试技术越来越得到重视。目前，荧光映像板读取器(fluorescence imaging plate reader,