产前分子诊断中需要注意的若干问题(郑主任)修改(1)

• X连锁遗传病基因携带者孕妇
• 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇 • 夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者；夫妇核型虽正常，但生育过染色体病患儿的孕妇。 • 夫妇之一有开放性神经管畸形，或是生育过这种畸形儿的孕妇 • 夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇
一、产前诊断的基本概念
（四）产前诊断技术
或者IgG抗体滴度增加4倍
• IgG抗体亲和力测定：亲和力指数<30％，提示孕妇CMV感染为近2-4个月内的原发性感染。IgM抗体阳 性伴随低亲和力IgG抗体在诊断母体原发性CMV感染方面优于单纯血清抗体检测。 • 病毒的分离培养或PCR检测感染的血液、尿液、唾液、宫颈分泌物或母乳乳汁诊断。
四、巨细胞病毒的检测
脐带血 核型 或核型+FISH 或核型+NGS FISH：1w 核型：3w NGS：10个工作日
Βιβλιοθήκη Baidu方法
报告时间
10个工作日
二、染色体核型分析
（二）典型案例分析A：女，36，体格检查未见明显异常
染色体核型：46，X，del （X）（q25）
二、染色体核型分析
（二）典型案例分析B：男，50，身体健康
染色体核型：45，XY，rob（13；13），-13，-13
1. 巨细胞病毒感染的现况
2. 胎儿先天性巨细胞病毒感染的后果
3. 巨细胞病毒的血清学检测
4. 巨细胞病毒的分子检测
5. 重视孕妇和新生儿的巨细胞病毒的检测
四、巨细胞病毒的检测
1.巨细胞病毒感染现况
巨细胞病毒血清学检测 IgG和IgM滴度 IgG亲和力
四、巨细胞病毒的检测
1.巨细胞病毒感染现况
宫内感染(先天性 CMV感染)
传病或先天性畸形做出准确诊断，以预防患儿的出生，是预防优生学的重要 组成部分。
一、产前诊断的基本概念
（一）产前诊断的意义
1.优生的重要措施，减少出生缺陷，提高全民素质 2.减轻家庭及社会的经济负担 3.阻断致病基因在家族中的传递
4.给孕妇有更大的空间和更多的选择，对于高危孕妇同样可以怀孕并且得到一
二、NIPT/CNV
（二）CNV结果的解读
• 发现明确致病的基因组拷贝数变异（CNVs）
• 未检出染色体非整倍体或100kb以上已知明确致病的基因组拷贝数变异（CNVs）
• 其他类型100Kb以上的拷贝数变异（CNVs） 数据库中没有记录的 数据库中记录为多态性的
二、NIPT/CNV
CNV结果分析
二、染色体核型分析
（一）应选择合适的时期和方法进行染色体相关疾病的产前诊断
孕期 12-26+6w ＜16w 16-22w 24-28w
样本
外周血胎儿 DNA NIPT
绒毛 核型 或核型+FISH 或核型+NGS FISH：1w 核型：3w NGS：10个工作日
羊水 核型 或核型+FISH 或核型+NGS FISH：1w 核型：3w NGS：10个工作日
临床意义 样本类型 外周血 羊水 43 0 没有检出 致病性CNV 1 24 意义不明 10 1 CNV多态性 7 1 总例数 61 26
流产物
脐血 总数
34
1 78
11
0 36
5
0 16
3
0 11
53
1 14
CNV异常结果
特别关注！！！
多态性 18%
不明原因 25%
致病性 57%
四、巨细胞病毒的检测
产前分子诊断中需要注意的若干问题
武汉大学中南医院产前诊断中心 武汉大学中南医院临床基因诊断中心/检验科 郑 芳
目 录
产前诊断 基本概念 染色体核 型分析 NIPT/CNV 巨细胞病 毒的检测
一、产前诊断的基本概念
（一）产前诊断的定义 产前诊断，又称宫内诊断或出生前诊断，是对胚胎或胎儿是否患某种严重遗
？
二、染色体核型分析
（三）多种方法交叉使用B——Angelman综合征
• 愉快木偶综合征（快乐天使综合征）
• 染色体异常：15q11-q13缺失 • 发病率：1/40000
• 临床特征：小头畸形、严重智力障碍、 语言障碍、共济失调步态、好动、无 意识发笑 • 机制：母源性15q11-q13缺失或 UBE3A基因突变
孕妇年龄30岁，孕27周，NIPT多次上机均提示T18高风险。 胎儿B超未发现任何异常，羊穿显示为46，XY。 后来CNV分析显示为母体18号染色体短臂微重复所致的假阳性。
影响无创产前筛查的因素
• 母体染色体核型异常：
• • • • • • •
母体的实质肿瘤：发生内在基因组成改变的状况 胎盘嵌合体（confined placental mosaicism，CPM） 染色体单亲二倍体（uni-parentaldisomy, UPD） 胎儿嵌合 孪生儿消失现象 胎儿游离DNA浓度太低： 实验室操作错误
分析前质量控制
孕周 （>12W） 妊娠情况（单胎/双胎/多胎?） 既往病史
知情同意非常 重要！！
如异体输血、移植手术、干细胞治疗、免疫治疗、肿瘤、病毒感 染等可能引入外源DNA或改变胎儿游离DNA的组成和比例，影响检 测结果） 样本状态及运输 溶血？是否及时采用冷链运输
分析中质量控制
合理的实验室分区
严格的实验室环境控制（如温湿度，稳压或不间断电源）
仪器设备及管理（PCR仪、离心机、加样器等定期维护并校准） 人员资质及培训
产物分析区 扩增区
空气流向 空气流向 缓冲间
标本制备区
空气流向 缓冲间
试剂准备区
空气流向 缓冲间
专用走廊
工作流向
产前筛查与产前诊断（全基因组低拷贝测序技术）
二、染色体核型分析
（二）典型案例分析C：
刘××，女，表型正常
45，XX，rob（14；21）（q10；q10）
二、染色体核型分析
（三）多种方法平行使用A——3号和5号染色体平衡异位患者胎儿CNV检测
女方：28岁，孕3产 0，胎停育2次，染色 体核型：46XX, t （3;5）(q25；p15)
男方：核型正常 孕20周，外院影像学 排畸没有发现异常
产前诊断技术包括两方面：
取材技术 、实验室检测技术
取材技术 非侵入性： 超声波检查 母血胎儿细胞检查 母血胎DNA/RNA检查
侵入性： 绒毛取样（ 孕 7-9周） 羊膜腔穿刺（孕 16-20周） 脐带穿刺（孕 20-24周） 胎儿镜检查（孕 18-20周）
一、产前诊断的基本概念
产前诊断检测技术应用范围
二、染色体核型分析
患儿染色体核型未见异常
二、染色体核型分析
FISH检测结果示：15q11-q13缺失
二、染色体核型分析
（三）多种方法交叉使用——核型正常，B超异常的染色体因素深度排查
33岁孕妇，孕24周，46，XN，B超提示胎儿多处软指标异常，表现为胎儿颈后软组织增厚，肠管回声增强，单脐动脉，对培养后 的羊水细胞进行了高通量测序染色体异常检测，结果显示：存在1处染色体结构异常：22q11.21-22q11.23存在2.3M缺失，该片段包 UBE2L3,YDJC,CCDC116等几十个基因或基因片段。22q11.21-22q11.23区域的片段缺失与22q11.2缺失综合征（22q11.2 deletion syndrome）有关，临床表现为身材矮小，面部异常，智力障碍等。
IgG抗体检测阳性率：>90%
IgM抗体检测阳性率（4.5个月） 产科+生殖科： 11/1038=0.0106 儿科：41/940=0.0436
围产期感染
四、巨细胞病毒的检测
2. 胎儿巨细胞病毒感染 • 我国育龄妇女几乎均为巨细胞病毒抗体阳性；
• 巨细胞病毒的先天性感染是儿童感觉神经性耳聋最主要的病因，早期诊
断价值高；
• 抗体阳性孕妇对巨细胞病毒的垂直传播并不低于孕期胎儿的原发性感
染。
原发性感染 复发性感染 潜伏在体内的CMV被重 新激活 再次感染外源性其他血 清型的病原体。 垂直传播：病毒血症孕妇的垂 直传播率高达44%
90%出生时没有症状，后遗症13%
10%出生时有症状，60%的后遗症： 听力、视力、智力，脑发育和肝脾、 血液系统等（7岁前发生） 羊水的病毒载量与垂直传播风险和 后遗症的症状相关
不良妊娠结局：死胎
四、巨细胞病毒的检测
3. 识别妊娠期母体原发性CMV感染困难
• 如果妊娠前的免疫状态未知，诊断基于特异性IgM抗体，特异性IgM抗体阳性的孕妇只有部分为原发性感
染 • 复发性感染孕妇中也可检出IgM抗体，并且原发性感染数月后血清中还可检出IgM抗体 • IgM抗体阳性可能还包括IgM抗体假阳性者 • 抗体：间隔3～4周后重复测定诊断依据包括血清转化现象(初次血清抗体阴性的孕妇出现特异性IgG抗体)，
分析中质量控制
文库浓度测定： 1.qPCR法/Qubit对DNA浓度准确定量；2.Aiglent 2100对文库的质量进行定性
荧光定量标准曲线法
2100检测结果
准确的文库质检是后续获得高质量、均一数据的关键
分析后质量控制
分析完成后，首先查看原始数据量，Q30，对照品结果和GC偏移度是 否通过等等.. 下机样本数据要求
审核项 原始数据量（M） Q30(1000个碱基中的错误率) Unique reads数量（M） 数据要求 ≥3.5M ≤85 ≥2M 异常处理 重上机 重上机 重上机
比对率
Duplication率 样本GC含量
≥62.5%
≤15% EDTA: 38%-42% Ardent: 35%-42%
重建库
重建库 重建库
二、NIPT/CNV
（一）NIPT结果分析
结果 检测项目 21三体 性染色体异常 阳性 0.199% 0.155% 真阳性 0.111% 0.044% 假阳性 0.044% 0.044% 假阴性 0.022% ----？
拒绝随访/失联 0.044% 0.066%
二、NIPT/CNV
1. NIPT的假阳性 胎儿染色体核型分型
New England Journal of Medicine，371;6 577-578（2014）
胎盘嵌合-假阴性
Molecular Cytogenetics. 2014, 7:48 17周NIPT检测结果：45，XO；羊穿结果：47，XX，+18
21
假阴性原因排查过程
• 原因排查过程 取样：母亲血细胞DNA、胎儿组织、胎盘组织 分析方法：测序、FISH和CMA 母亲核型正常 46，XX （排除母体干扰） NIPT FISH SNParray 流产的胎儿组织： T18 胎盘组织：45, X (~60%) and T18 (嵌合率~30%) 流产的胎儿组织： T18 胎盘组织：45, X cells (67%, 62/92) and T18 cells (30%, 28/92) 流产的胎儿组织： T18 胎盘组织：45, X cells (67%) and T18 cells (50%) 胎儿为100%浓度的47，XX，+18 胎盘嵌合，大部分细胞为45,XO; 少量细胞为47，XX，+18
检测项目 21三体
结果
阳性 0.199%
真阳性 0.111%
假阳性 0.044% ？ 0.044%
假阴性 0.022%
拒绝随访或失联 0.044%（个别拒 绝随访） 0.066%
重视知情同意 2.NIPT的假阴性
重视影像学的检查
性染色体异常
0.155%
0.044%
-----
胎盘嵌合-假阳性发生率约1/1000
母体自身染色体异常干扰
样本ID 18010072 18010072 18010072 18010072 实验编号 1 2 3 4 chr13 -0.426 -0.576 -1.109 -1.015 chr18 3.713 3.229 4.207 2.816 chr21 -1.256 0.366 -0.676 -0.631
测序区
空气流向
文库扩增与检 测区
空气流向
标本与文库制 备区
空气流向
试剂准备区
空气流向
缓冲间
缓冲间
缓冲间
缓冲间
专用走廊
工作流向
分析中质控
胎儿游离DNA浓度测定方法 多重SNP法 (>4%) Y染色体法
文库构建--DNA片段筛选
尽可能消除母体基因组DNA的背景干扰，富集游离DNA（
cfDNA）
个健康的小孩 5.考虑要保存患病胎儿的孕妇，提供宫内治疗的可行性，提供良好的产前治疗 依据
一、产前诊断的基本概念
一级预防
出 生 缺 陷 的 三 级 预 防 孕前 植入前
二级预防
产前
三级预防
新生儿
筛查
筛查/ 诊断
筛查/诊断
筛查/诊断
一、产前诊断的基本概念
（三）产前诊断的指征
• 35岁以上的高龄孕妇 • 羊水过多的孕妇 • 有原因不明的习惯性流产史的孕妇 • 具有遗传病家族史，或系近亲婚配的孕妇