分子生物学_研究方法(上)

1.2 转基因方法
1.2.1 细菌转基因的方法 (1)结合（conjugation） (2)转化（transformation）(常规转化、电转化等) (3)转染（transfection） (4)转导（transduction）
1.2.2 动物转基因的方法 (1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)电导转基因法 (3)逆转录病毒介导法 (4)胚胎干细胞介导法 (5)精子载体法
(t1/2 = 4.5×109a)
放射性强度的探测
（1）盖革计数器（Geiger counter tuber）， 闪烁计数器。
（2）放射自显影：X-光乳胶片覆盖于样品，在 黑暗中，-70℃，曝光。
放射性分子的制备：核物理，化学，生化反 应，生化分离技术
核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备DNA放射性探针
复制机制。
(3)50年代末至60年代，相继提出了“中心法则” 和操纵子学说, 成功地破译了遗传密码，充分 认识了遗传信息的流动和表达途径。
1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处 理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。
1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细 胞同样能够摄取质粒DNA。
1.3.2 分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。
Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。
末端转移酶
在双链核酸的3ˊ末端加上多聚单核苷酸
DNA外切酶III
从DNA链的3ˊ末端逐个切除单核苷酸
λ 噬菌体DNA外切酶
从DNA链的5ˊ末端逐个切除单核苷酸
碱性磷酸酯酶
切除位于DNA链5ˊ或3ˊ末端的磷酸基团
科学家已几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段， 再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。
1.2.3 植物转基因的方法 (1)Ti质粒介导 (2)电转化法 (3)基因枪法
1.3 核酸的分子杂交
1.3.1 放射ห้องสมุดไป่ตู้同位素技术
同位素：原子序数相同而质量不同的元素。
放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳 定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位 素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生α 射线、β -射线和γ -射线等，同时从不稳定同位素 变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用 的是放射性同位素。
从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。
基因工程的主要内容或步骤
“分---切---连---转---筛”
（1）从基因组中分离、或PCR扩增、或人工合成带有目的 基因的DNA片段。 （2）用适当的限制酶分别切割适当的载体分子和含有目 的基因的DNA分子。 （3）将目的基因连接到载体分子上，形成重组DNA分子。 （4）将重组DNA分子转移到适当的受体细胞中并增殖。 （5）筛选重组转化子，扩增目的基因。再将目的基因克 隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。
蛋白质与核酸相互作用 DNA分型 DNA核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图
琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 - 50kb之间
聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1000个碱基对
凝胶类型及浓度 0.3%琼脂糖 0.7%琼脂糖 1.4%琼脂糖 4.0%聚丙烯酰胺 10.0%聚丙烯酰胺 20.0%聚丙烯酰胺
1 DNA操作技术
• DNA分子的切割与连接 • 核酸分子杂交 • 凝胶电泳 • 细胞转化 • 核酸序列分析 • 基因的人工合成 • 基因的定点突变 • PCR扩增 • 基因敲除
1.1 核酸的凝胶电泳
原理： 种类：琼脂糖（agarose）凝胶电泳；
聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶电泳 用途：鉴定重组DNA分子
分离DNA片段的大小范围（bp） 50 000~1 000 20 000~1 000 6 000~300 1 000~100 500~25 50~1
凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶 浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高， 孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低， 孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
识别并在特定位点切开DNA 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子
DNA聚合酶I（大肠杆菌） 按5ˊ到3ˊ方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口
反转录酶
按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链
多核苷酸激酶
把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5ˊ-OH末端（进行末端标 记实验或用来进行DNA的连接
放射性的衰变类型 α -射线：带正电荷的高速粒子流 β -射线：带负电荷的粒子流 γ -射线：光子流
分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质
元素名称 半衰期 12.1年 5700年 14.3天 87.1天 5.8年
147N + 10n → 146C + 11H 146C → 147N + 0-1e 23892U → 20682Pb + 842He + 60-1e
基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具 有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因 置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的 能力。
1962年Arber 发现限制性核酸内切酶， 1967年Gellert发现了 DNA 连接酶。
酶类
重组DNA实验中常见的主要工具酶
功能
限制性核酸内切酶 DNA连接酶
第五章
分子生物学研究方法（上）
本章主要内容
常见的DNA操作技术 基因克隆技术简介 蛋白质组学及研究技术
引言
重组DNA技术发展史上的重大事件
(1) 40年代，解决了遗传的物质基础问题。确定了
遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋 白质。
(2)50年代，解决了基因的自我复制和世代交替问 题。建立了DNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留