肺炎支原体抗体明胶凝集试验标准操作程序

肺炎支原体抗体明胶凝集试验标准操作细则

1、目的

对肺炎支原体抗体明胶凝集试剂使用进行必要的细化和补充，以规范本试剂的操作程序，正确使用本试剂,保证检测结果准确。

2、适用范围

操作适用于采用肺炎支原体抗体明胶凝集试剂的所有操作。

3、试剂厂家

日本富士公司

4、工作程序

（一）、原理

利用纯化的肺炎支原体抗原包被明胶颗粒，此致敏的明胶颗粒将与人血清或血浆中的肺炎支原体抗体结合产生可见的凝集反应。

本试剂有如下优点：

（1）操作简便，无需特殊设备。即可对单个标本进行检测，也可用于大规模普查。

（2）反应时间短：孵育时间仅3小时，随后肉眼观察结果。

（3）高度特异性：本试验中所用的载体为人工制造的明胶颗粒，由富士公司独创。与其它同类试剂中所用的生物载体相比（如TPHA 中的红细胞），最大限度地降低了非特异凝集反应。

（二）、试剂盒内容

“A”稀释液（Sample Diluent）用于溶解致敏颗粒“B”和非致敏颗粒“C”及标本的稀释。

“B”致敏颗粒（Sensitized Particles）：为冻干粉，用前30分钟按规定量加“A”液溶解混匀。是包被有肺炎支原体抗原的明胶颗粒。

“C”非致敏颗粒（Unsensitized Particles）：为冻干粉，用前30分钟按规定量加“A”液溶解混匀。

“D”阳性对照（Positive Control）：为含肺炎支原体抗体的兔血清

制成，最终滴度1:320。其试验方法与定量试验同，可稀释至第7或第

8孔则可。必要时才做此对照试验。

滴管（25µl /滴）：1个，分别用于致敏颗粒（“B”液）或非致敏颗粒（“C”液）的吸取，请勿混用。

U型微孔板2块

需自备的材料：刻度吸管，微量移液器及吸头，托盘式混匀器（注：不可用涡旋式振荡器）

（三）、试验方法：用U形反应板

1、定性试验

孔序 1 2 3 4

加血清稀释液“A”（μl）100 25 25 25

血清标本（µl）25 →25 → 25 → 25 →弃去25μl

标本稀释度 1:5 1:10 1:20 1:40

加非致敏颗粒“C”（µl） 25

致敏颗粒“B”（µl）25

血清终滴度1:40 1:80

置微型振荡器振摇1分钟，置有盖湿盒内，室温静置3小时后观察结果。

2、定量试验

孔序 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

加“A”液（μl）100 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 弃去血清标本（μl）25→25→25→25→25→25→25→25→25→25→25→25→25μl 血清稀释度1:5 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240

加“C”液（μl）25

加“B”液（μl）25 25 25 25 25 25 25 25

血清最终稀释度1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:10240 用血凝振荡器振摇1分钟，置湿盒内加盖，室温静置3小时后，观察结果。

（四）、结果判断：先观察各孔的凝集情况

“-”/不凝集：颗粒集中在孔中央呈钮扣状，边缘光滑

“±”/可疑：颗粒浓集呈边缘光滑的圆环

“+”/凝集：颗粒形成多形性粗糙环状

“++“/强凝集：颗粒覆盖于整个孔底，呈多形性膜状，边缘粗糙。

根据各孔中的反应情况报告结果：

阳性——与未致敏颗粒（1:40终浓度）不凝集；与致敏颗粒（1:80或更高终浓度）凝集。定量检测时凝集的最高稀释度即为抗体滴度。

阴性——与致敏颗粒（1:80终浓度）不凝集。

可疑——与未致敏颗粒（1:40终浓度）不凝集；与致敏颗粒（1:80终浓度）呈可疑反应。

（五）、重吸收试验

孔内标本与非致敏颗粒均产生凝集者，此标本需作下列重吸收试验。

1、加0.95ml非致敏颗粒溶液于小试管内。

2、加入50µl血清。充分混匀，置室温吸收30分钟以上。

3、离心2000rpm×5分钟。吸取上清液50µl加入孔3。

4、自孔4至12各加血清稀释液“B”25µl。

5、自孔3吸25µl至孔4。混匀后吸25μl至孔5……如此稀释至孔12弃去25µl。

6、按定量试验法加入“D”和“C”，振摇1分钟。置有盖湿盒室温2小时，观察结果。

（六）、注意点

1、每次用前应将“B”和“C”恢复室温并充分摇匀。本试剂盒内配有专用滴管。用于加“B”和“C”液。应严格标明“B”和“C”。不能混用。此滴管每滴为25µl。该滴管不能用来稀释血清。

2、试验中加入“B”和“C”颗粒后，应用微型血凝振荡器混匀。不能用旋转式振荡器旋摇。

3、红细胞及其他血液有形成分会影响结果，所以血液标本应离心分离血清，血清标本无需灭活。

4、在疾病早期，抗体滴度较低，可出现阴性结果。而当抗体滴度很高时，在低稀释度孔中也可出现不凝集（前带现象）。当病人用过血液制品（如免疫球蛋白）时，可出现假阳性结果。无论何时，实验结果均应与临床症状/体征相结合。

5、保存：本试剂应置于2-10℃冰箱保存。