酶解法制备壳寡糖的初步研究

壳聚糖（ Chitosan） 是由甲壳素（ Chitin） 经脱乙酰基而制 得的多糖［1］，学名为 β-（ 1，4） -2-氨基-2-脱氧-D-葡聚糖。壳 聚糖在自然界中的储量丰富，广泛存在于虾、蟹和昆虫的外 壳及藻类、真菌的细胞壁中，是年产量仅次于纤维素的天然 高分子化合物［2］。壳聚糖在制药、食品、化妆品等领域有较 广泛的应用，具有安全、无毒、成膜、抑菌、可食用、可降解等 特性。然而，由于壳聚糖分子量很大，有紧密的分子结构，溶 解性能差，只能在酸性介质中溶解，壳聚糖的应用受到极大 的限制［3］。壳寡糖（ Chito-oligosacchaside） 是壳聚糖降解的产 物，不仅保持壳聚糖的良好性能，而且具有较低的分子量和 良好的水溶 性，具 有 提 高 人 体 免 疫 力、促 进 伤 口 愈 合、抗 肿 瘤、促进脾脏抗体的产生、强化肝脏功能、增殖人体肠道双歧 杆菌、降血脂、降血压等独特的生理活性［4］。为了更经济、更 安全地获得壳寡糖，选择适当的方法对壳聚糖进行降解就显 得尤为重要。
开来，最后得到纯化的壳聚糖酶（ 图 3） 。
2. 4 酶活力的测定 1 个酶活力单位（ U） 定义为在上述活
力测定条件下 1 min 内 1 μmol 还原糖所需酶的量。经测定，
重组表达的壳聚糖酶活力为 700 U / mg。
2. 5 水解产物的分析
2. 5. 1 硅胶板薄层层析。硅胶薄板层析能直观地显示出水
ml 浓度 30% 氨水混合溶液） 中分离，0. 5 ～ 1. 0 h 后取出，于
90 ℃ 彻底烘干，喷洒显色剂（ 浓度 0. 1% 茚三酮溶液溶于正
丁醇饱和溶液中） ，烘干至出现红点，观察、分析水解产物。
1. 7. 2 壳寡糖平均链长的测定。分别取 10 μl 每隔 30 min
取样的 各 管 溶 液 于 0. 8 ml K3 Fe （ CN） 6 （ 溶 于 0. 5 mol / L Na2 CO3 中） ，放入沸水锅中煮沸 5 min，以转速 12 000 r / min 离心 5 min，除去沉淀，用紫外分光光度计测定各管溶液在波
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci. 2010，38（ 4） ： 1684 － 1686
责任编辑 刘月娟 责任校对 张士敏
酶解法制备壳寡糖的初步研究
田 昀，张柿平，郭占云* （ 同济大学生命科学与技术学院，上海 200092）
摘要 ［目的］研究制备壳寡糖的方法。［方法］运用基因工程的方法，将人工构建的含有壳聚糖水解酶基因的质粒载体转入大肠杆菌 体内并诱导其表达。［结果］可溶的活性壳聚糖酶在大肠杆菌中的表达量高于 300 mg / L。［结论］该重组壳聚糖酶与天然来源的壳聚糖 酶具有完全相同的比活力，能专一性切断 β-1，4-糖苷键，将壳聚糖降解为不含单糖的壳寡糖。 关键词 壳聚糖； 壳寡糖； 壳聚糖水解酶 中图分类号 Q 946. 3 文献标识码 A 文章编号 0517 － 6611（ 2010） 04 － 01684 － 03
解反应的进行程度，不同链长的水解产物以红点显现在硅胶
薄板上。从图 4 可以看出，1 h 时的点偏淡且稍显连续，并短
于其他时间的点链，说明水解不充分； 各个时间三糖位置的
注： 从左向右依次为标记、第 1 道诱导后菌液、第 2 道未诱导的 菌液。
Note： The lanes are marker，bacteria liquid after induction and bacteria liquid before induction from left to right. 图 1 诱导壳聚糖酶表达电泳 Fig. 1 Electrophoresis of induced chitosanase
可将 Fe（ CN） 3 （ 黄色） 还原为 Fe（ CN） 2 （ 无色） ，加入壳聚糖 酶后，壳聚糖被水解为壳寡糖，大量糖苷键被切开，露出大量 醛基末端，Fe3 + 被还原，加入酶的量越多或反应时间越长，产
物的颜色越浅，因此测定产物的吸光度值可间接反映壳聚糖
的水解程度。取 30 g 壳聚糖粉末溶于 95 ml 水中，搅拌，加
目前，壳聚糖的降解方法主要有酶降解法、化学降解法 及物理降解法 3 种［5］。与其他方法相比，酶降解法具有许多 优点，如酶法降解过程以及降解产物的相对分子质量（ 即聚 合成寡糖的单糖数量） 均更容易控制，而且酶法降解在较温 和的条件下进行，可专一性地切断 β-1，4-糖苷键，反应过程 中不消耗大量的化学试剂，对环境污染较小［6 －7］。用于催化 降解壳聚糖的壳聚糖酶可通过从菌株中直接分离纯化，例如 从土壤中筛选出的霉菌 M19［8］、酶菌株 P003［9］、菌种 Y4［10］。 笔者采用郭占云先生构建好的壳聚糖表达载体 pET / chitosanase，将其转入大肠杆菌体内，诱导表达专一性壳聚糖水解 酶，避免了筛选产酶菌种时摸索条件的繁琐，并且提高了壳 聚糖酶的比活力。 1 材料与方法 1. 1 材料 供试壳聚糖购自国药集团，脱乙酰度大于 90% 。
基金项目 作者简介 收稿日期
2008 年上海市大学生创新性试验计划项目； 2008 年同济大 学“大学生创新性实验计划资助项目”。 田昀（ 1987 － ） ，女，江苏姜堰人，本科生，专业： 生物技术。 * 通讯作者。 2009-11-23
1. 2 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 将大肠杆菌 BL21（ DE3） star 菌株接种于 2 ml LB 液体培养基中，37 ℃ 振 荡培养 12 h。取 500 μl 菌液转入 500 ml LB 液体培养基中， 于 37 ℃ 振荡培养（ 转速为 300 r / min） 至菌液在波长 600 nm 处的吸光度为 0. 2。取出菌液，冰浴 15 min，于 4 ℃ 、5 000 r / min离心 5 min，倒去上清液，用 0. 1 mol / L 氯化钙溶液悬浮 沉淀。重复上述步骤，即可制得感受态细胞。
入 5 ml 冰乙酸促进其溶解，搅拌至黏稠状，加入纯化后的壳
聚糖酶，放入 50 ℃ 水浴锅中反应 10 h，每隔 30 min 取样1 次。
1. 7 水解产物的分析
1. 7. 1 硅胶板薄层层析。取 3 μl 30 mg / ml 水解产物在预热
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过的硅胶板上点样，烘干后放入展开剂（ 100 ml 正丙醇和 50
Preparation of Chito-oligosacchaside with Enzyme Digestion TIAN Yun et al （ School of Life Sciences and Technology，Tongji University，Shanghai 200092 ） Abstract ［Objective］The research aimed to study the preparation of chito-oligosacchaside. ［Method］Gene engineering was used to transfer plasmid，which contained the gene of chitosan-hydrolyase，into E. coli. Then the enzyme was induced to express. After purification，chitosanhydrolyase was used to degrade chitosan. ［Result］The amount of the expression of chitosan-hydrolyase in E. coli was higher than 300 mg / L. ［Conclusion］The recombinate chitosan-hydrolyase had the same specific activity with the chitosan-hydrolyase from nature. It could specifically break β-1，4 glycosidic bonds and degrade chitosan to chitosan-hydrolyase with no monosaccharide. Key words Hitosan； Chito-oligosacchaside； Chitosan-hydrolyase
38 卷 4 期
田 昀等 酶解法制备壳寡糖的初步研究
1685
U
=
260
×
ΔOD Δt × V
×
酶的稀释倍数 酶的浓缩倍数
（ 1）
式中，△OD 为对照（ 不加酶） 的吸光度值减去产物的吸光度
值； △t 为反应时间； V 为加入的酶量，μl。
1. 6 水解壳聚糖、制备壳寡糖重组壳聚糖酶的方法 壳聚
糖单体之间都以糖苷键的形式连接，只有末端有醛基，醛基
取上述感受态细胞 200 μl，加入重组质粒 10 ng，混匀，冰 浴 30 min，置于 42 ℃ 水浴 90 s，再冰浴 2 ～ 5 min，加入 500 μl LB 液体培养基，于 37 ℃ 、200 r / min 复活 45 min，取适量转化 细胞涂布于氨卞选择性培养基上，37 ℃ 培养 12 h 后可见转 化菌落，同时做阴性对照。 1. 3 菌种的扩大培养及酶的诱导表达 挑取上述阳性克隆 接种于 2 ml 含 Amp 的 LB 液体培养基中，37 ℃ 振荡培养 12 h，将大肠杆菌转到 50 ml LB 液体培养基振荡培养，同时加入 100 μg / ml Amp 进行筛选，每隔 3 ～ 4 h 补加 5 ml 10 × LB 液 体培养基，补加 2 次之后加入诱导剂 IPTG，诱导表达而得到 专一性壳聚糖水解酶溶液。 1. 4 酶的分离纯化 取诱导后的菌液离心，悬浮于 pH 值 7. 5 的磷 酸 缓 冲 液 （ PBS） 中，超 声 破 碎，离 心 取 上 清 进 行 FPLC 镍柱分离纯化。步骤如下： 先用水清洗柱子，再用 PBS 清洗，上样后，依次用 30、100、250 mmol / L 咪唑溶液收集洗脱 峰，测定各组分酶活力。用蒸馏水进行清洗，浓度 20% 乙醇 封柱，备用。 1. 5 酶活力的测定 取 0. 5 g / L 壳聚糖溶液 0. 6 ml 作为酶 反应底物，并溶解在 pH 值 4. 5 的 0. 1 mol / L NaAc-HAc 缓冲 液中，加入适量壳聚糖酶（ 0. 005 ～ 0. 010 U 酶，体积 5 ～ 10 μl，可稀释） 。50 ℃ 预热 10 min，加入不同量的专一性壳聚糖 水解酶反应 15 min，然后加入 0. 8 ml K3 Fe（ CN） 6 （ 溶于 0. 5 mol / L Na2 CO3 中） 进行显色反应，放入沸水锅中煮沸 5 min， 转速 12 000 r / min离心 5 min，除去沉淀，用紫外分光光度计 测上述各管溶液在波长 595 nm 处的吸光度值。酶活力可按 照以下公式计算。
离心的残留因素，即可认为沉淀中几乎没有壳聚糖酶； 上清
液泳道中酶的条带很亮，表明壳聚糖酶存在于上清液中。
2. 3 壳聚糖酶的分离纯化 壳聚糖酶的氨基酸序列中设计
有 6 个连续的组氨酸，可以与镍发生紧密结合，而天然的其
他蛋白质氨基酸序列中出现 6 个连续的组氨酸的机率非常
小，故可用 100 mmol / L 咪唑将目的蛋白与其他杂蛋白分离
IPTG 的菌液中没有壳聚糖酶条带（ 或不明显） ，而加入 IPTG
后出现条带，表明诱导剂 IPTG 诱导了壳聚糖水解酶的表达。
2. 2 壳聚糖酶所存在的部位 分别取离心后的上清液和沉
淀进行 SDS-PAGE 电泳检测。从图 2 可以看出，沉淀泳道条
带窄且模糊，说明沉淀中酶的含量非常少，排除超声破碎和
长 420 nm 处的吸光度值。
水解产物的平均链长可按照以下公式计算。
平均链长
=
总糖残基量 还原糖残基量
（ 2）
式中，还原糖残基量 = 41. 7 × △OD 。
2 结果与分析
2. 1 壳聚糖水解酶的诱导表达 分别取加入诱导剂 IPTG
前后的菌液进行 SDS-PAGE 电泳。从图 1 可以看出，未加