青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及染色体的核型分析

青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及染色体的核型分析
陈钧瑜
（中山大学生命科学学院08级生物技术广州510275）
摘要：染色体组型具有物种的特异性，它们在遗传过程中是相对稳定的，因此可以作为物种分类的基本依据之一。

本实验以青蛙的骨髓为材料，制备了青蛙骨髓细胞染色体标本，选择形态完好的中期分裂相进行拍照放大，用常规统计方法测量染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数等。

结果表明青蛙骨髓细胞二倍染色体数目为26，可配成13对同源染色体，其中有5对大型染色体（相对长度>9%）和8对小型染色体（相对长度<7%）；8对为中部着丝粒染色体，其余5对为亚中部着丝粒染色体。

青蛙骨髓细胞染色体核型公式为K(2n)=26 =13n=16m+10sm。

关键词：青蛙；骨髓细胞；染色体；核型
1、引言
核型一词首先由前苏联学者TA 列维茨基等在上世纪20 年代提出,它是指每种生物染色体的数目、大小和形态等特征的总和。

染色体核型或组型分析(Chromosome karyotype analysis) 是染色体研究中的一个基本方法。

染色体组型是细胞分类学的重要数据，也是从细胞遗传学角度了解物种间亲缘关系的有效途径，对染色体核型分析,不仅有助于了解生物的遗传组成、遗传变异规律和发育机制,而且对预测鉴定种间杂交和多倍体育种的结果、了解性别遗传机理以及基因组数、物种起源、进化和种族关系的鉴定都具有重要的参考价值[1]。

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂的细胞。

经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。

用Giemsa染色法制备骨髓细胞染色体标本，所得标本清晰无缺失与重叠[2]，用显微拍摄技术采集染色体的电子图片信息，后期用Adobe公司的Photoshop软件优化处理照片[3]]，获得完整、清晰的染色体核型，并采用Levan[4]的方法进行核型分析。

2 材料与方法
2.1 材料
青蛙
2.2 方法
2.2.1 实验方法[2]
（1）秋水仙素处理：实验前3～4小时，按动物每克体重2～4μg的剂量，腹腔注射秋水仙素。

（2）取股骨：处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉。

（3）收集骨髓细胞：用刀片剪开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，。

将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min 离心10min。

（4）低渗处理：弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置37℃温箱中低渗20min。

（5）预固定：加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min 离心10min后，弃上清液。

（6）固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定20min。

1000r/min 离心10min后弃上清液。

（7）重复步骤6的操作。

（8）沉淀物中加入0.3~0.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。

（9）滴片：用镊子去预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方
向吹气，使细胞分散均匀，然后置于酒精灯上微微加热干燥。

（10）染色：将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液（Giemsa原液用10倍体积的1/15M 磷酸缓冲液（pH7.4）稀释）染色30min。

（11）镜检：在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察，并显微照相。

2.2.2 分析方法
用Photoshop软件优化处理照片，获得完整、清晰的染色体核型。

核型分析中染色体相对长度、臂指数和类型均按Levan的标准[4]，相对长度（relative length）=每个染色体长度/单倍染色体总长度，臂指数（arm index）=长臂长度/短臂长度，着丝粒指数（centromere index）=短臂长度/该染色体总长。

臂指数1.0-1.7为中部着丝粒染色体（m），臂指数1.7-3.0亚中部着丝粒染色体（sm），臂指数在3.0-7.0之间的为亚端部着丝粒，臂指数> 7.0为端部着丝粒染色体（t）；着丝粒指数在50.0%～37.5%之间称中部着丝粒染色体（m）；着丝粒指数在37.5%～25.0%之间称亚中部着丝粒染色体（sm）；着丝粒指数在25.0%～12.5%之间称亚端部着丝粒染色体（st）；着丝粒指数在12.5%～0.0%之间称端部着丝粒染色体（t）；相对长度> 9 %的为大型染色体组，相对长度< 7 %的为小型染色体组。

3 结果与分析
3.1 青蛙骨髓细胞染色体核型
青蛙脊髓细胞中期染色体形态（见图1），然后用魔术棒将每个染色体选取后粘贴到新的文件中，每个染色体一个图层。

用变换、旋转工具让染色体旋转到长臂朝下，短臂朝上。

分别通过各个图层的选择排布最后将26个染色体按长度由大到小排队，最后直接在计算机上输出核型图片（见图2）。

图1 青蛙骨髓细胞染色体中期分裂相
图2 青蛙骨髓细胞染色体核型（Photoshop处理）
3.2 染色体核型分析数据统计
利用量尺工具计算每条染色体的短臂长、长臂长、总长等数据根据获得的数量，将对应的染色体进行一一配对。

当所有染色体位置都摆放妥当后，编号1～13，合并所有图层并输出图片获得完整的核型分析图。

表1 青蛙骨髓细胞染色体核型数据
组别编号短臂长度长臂长度染色体全长相对长度臂指数着丝粒指数着丝粒位置Ⅰ 1 19.421.941.314.47 1.13 46.97m
Ⅰ 2 14.620.535.112.30 1.40 41.60m
Ⅰ 3 9.419.829.210.23 2.11 32.19sm
Ⅰ 4 11.217.128.39.92 1.53 39.58m
Ⅰ 5 9.216.525.79.00 1.79 35.80sm
Ⅱ 6 5.413.318.7 6.55 2.46 28.88sm
Ⅱ7 610.816.8 5.89 1.80 35.71sm
Ⅱ8 7.59.316.8 5.89 1.24 44.64m
Ⅱ9 7.39.416.7 5.85 1.29 43.71m
Ⅱ10 5.89.815.6 5.47 1.69 37.18m
Ⅱ11 68.314.3 5.01 1.38 41.96m
Ⅱ12 4.59.514 4.91 2.11 32.14sm
Ⅱ13 5.47.512.9 4.52 1.39 41.86m
表1列出了青蛙骨髓细胞的中期染色体的测量数据，即染色体的相对长度、臂指数和着丝粒指数，其中短臂、长臂长度为一对同源染色体的平均值。

根据以上统计结果可知：青蛙骨髓细胞二倍体染色体数目为26个，共13对，核型公式为：K(2n)=26=13n =16m+10sm，未分析性染色体。

按照染色体的相对长度和着丝点指数，可以把全部染色体分为为大型和小型两类，故分为Ⅰ、Ⅱ二组。

Ⅰ组（1-5号染色体）。

1号染色是所有染色体中最大一对中部着丝粒染色体，相对长度> 14.0，很容易区分。

2-5号染色体相对长度9.00-12.30。

依据相对长度和臂指数，2、4号两对染色体为中部着丝粒染色体，3、5号两对染色体为亚中部着丝粒染色体。

Ⅱ组（6-13号染色体）。

为小型染色体（相对长度<7.0），其中8、9、10、11、13五对为中部着丝点染色体，7号与8号染色体形状相似，平均相对长度相差较小，不易区分。

6、7、12号染色体为亚中部着丝粒染色体。

4 讨论
核型图中13对染色体配对情况良好，除了个别染色体未伸展完全或图像分辨率的问题，造成了些许同源染色体差异。

4．1对细胞类型的选择：
制作核型分析的染色体标本应选择分裂活性强的组织细胞类型，如本例中的蛙骨髓细胞，由于有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素的刺激，可直接观察到分裂细胞。

再经秋水仙素处理后，就被阻断在有丝分裂的中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本[2]
4．2传统分析方法和运用Adobe Photoshop进行核型分析优劣比较：
传统的建立一个物种核型图的方法是选择一个分散良好的有丝分裂中期的细胞拍照、冲洗；将照片上每条染色体一一剪下，测定每条染色体长度及各条臂长，再将染色体人工配对，按一定的规则将配对的染色体排列、粘贴，最后再翻拍成照片。

这个流程耗时而繁杂。

当一个物种(如人类)染色体数较多时核型分析更是如此。

如果染色体间存在交叉重叠，则只能多洗几张照片，沿着可能的轮廓线，将叠在下面的一条染色体连同另一条染色体的残臂一同剪下来体排列在核型图中。

在某些情况下，这种做法会得到令人误会的假象[3]。

4．3 实验过程中的注意事项[2]：
4.3.1低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。

低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失，不能准确计数；时间不足则染色体成团，不伸展，观察时无法区分和计数。

在室温较低时，宜在恒温箱中用37°C低渗20min。

4.3.2要掌握好秋水仙素的浓度和处理时间，浓度过高，处理时间过长，都会使染色体过分收缩，不仅由于染色体缩成一团不利于对其形态进行分析，甚至得到的长度数据没有任何意义。

4.3.3染色要深一些，但是脱色的时候要脱干净，这样才能保证染色体背景间有较大的对比度，图像也会更加清晰美观。

参考文献：
[1] 吴仲庆. 水产生物遗传育种学. 厦门:厦门大学出版社,7-25.
[2] 王金发,何炎明. 《细胞生物学实验教程》. 第一版. 北京：科学出版社, 2004: 83-85.
[3] 杨大翔.用Adobe Photoshop进行核型分析.农业网络信息，2005，(3)：45-47
[4] Levan A, Fredge K, Sangberg A A. Normene latrure for contromeric position on chromosomes. Herditas, 1964, 52: 201-220.
The marrow cells chromosome preparation and karyotype analysis of frog
Chen Junyu
（School of Life Science, Sun Yat-sen University, Guangzhou, 510275）
Abstract: There are specificities of the species in the karyotype, which keeps the relative stability in the inheritable process. Therefore, it has been one of the indexes to identify the kinds of animals. We utilize marrow cells from the frog to prepare for the chromosomal samples. The metaphase figure of divided cells is chosen and have photographs taken. The relative lengths, the arm ratio, the centromere index of chromosome and so on are measured. Results show that the frog diploid chromosome number 26, can be doubled 13 on homologous chromosomes, which were composed of five pairs of large chromosomes(relative length>9%)，and eight pairs of small chromosomes(relative length<7%); 8 pairs of them were metacentric chromosomes and the other pairs were sub metacentric chromosomes. The chromosomal karyotype formula of frog was 2n=26=20m+6sm.
Key words: frog; marrow cells; chromosome; karyotype。