青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及染色体的核型分析

青蛙骨髓细胞染色体标本的制备及染色体的核型分析

陈钧瑜

（中山大学生命科学学院08级生物技术广州510275）

摘要：染色体组型具有物种的特异性，它们在遗传过程中是相对稳定的，因此可以作为物种分类的基本依据之一。本实验以青蛙的骨髓为材料，制备了青蛙骨髓细胞染色体标本，选择形态完好的中期分裂相进行拍照放大，用常规统计方法测量染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数等。结果表明青蛙骨髓细胞二倍染色体数目为26，可配成13对同源染色体，其中有5对大型染色体（相对长度>9%）和8对小型染色体（相对长度<7%）；8对为中部着丝粒染色体，其余5对为亚中部着丝粒染色体。青蛙骨髓细胞染色体核型公式为K(2n)=26 =13n=16m+10sm。

关键词：青蛙；骨髓细胞；染色体；核型

1、引言

核型一词首先由前苏联学者TA 列维茨基等在上世纪20 年代提出,它是指每种生物染色体的数目、大小和形态等特征的总和。染色体核型或组型分析(Chromosome karyotype analysis) 是染色体研究中的一个基本方法。染色体组型是细胞分类学的重要数据，也是从细胞遗传学角度了解物种间亲缘关系的有效途径，对染色体核型分析,不仅有助于了解生物的遗传组成、遗传变异规律和发育机制,而且对预测鉴定种间杂交和多倍体育种的结果、了解性别遗传机理以及基因组数、物种起源、进化和种族关系的鉴定都具有重要的参考价值[1]。

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可直接观察到分裂的细胞。经秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。用Giemsa染色法制备骨髓细胞染色体标本，所得标本清晰无缺失与重叠[2]，用显微拍摄技术采集染色体的电子图片信息，后期用Adobe公司的Photoshop软件优化处理照片[3]]，获得完整、清晰的染色体核型，并采用Levan[4]的方法进行核型分析。

2 材料与方法

2.1 材料

青蛙

2.2 方法

2.2.1 实验方法[2]

（1）秋水仙素处理：实验前3～4小时，按动物每克体重2～4μg的剂量，腹腔注射秋水仙素。

（2）取股骨：处死动物后，立即取出股骨，用刀片剔掉肌肉。

（3）收集骨髓细胞：用刀片剪开股骨的两端，用盛有生理盐水的注射器插入股骨的上端，冲出骨髓细胞至离心管中，。将收集的骨髓细胞平衡后放入离心机，以1000r/min 离心10min。

（4）低渗处理：弃上清液，加入6ml蒸馏水，用吸管轻轻吹打成细胞悬浮液，置37℃温箱中低渗20min。

（5）预固定：加入5滴新配的固定液，立即打匀，并以1000r/min 离心10min后，弃上清液。

（6）固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，立即用吸管吹打成细胞悬液，室温下固定20min。1000r/min 离心10min后弃上清液。

（7）重复步骤6的操作。

（8）沉淀物中加入0.3~0.5ml固定液，用吸管吹打成细胞悬液。

（9）滴片：用镊子去预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2~3滴细胞悬浮液，立即用嘴向同一方

向吹气，使细胞分散均匀，然后置于酒精灯上微微加热干燥。

（10）染色：将晾干的玻片放在洁净的玻板上，用Giemsa染液（Giemsa原液用10倍体积的1/15M 磷酸缓冲液（pH7.4）稀释）染色30min。

（11）镜检：在低倍镜下找到中期分裂相的细胞，转用高倍镜，选择染色体分散适度、长度适中的分裂相进行观察，并显微照相。

2.2.2 分析方法

用Photoshop软件优化处理照片，获得完整、清晰的染色体核型。核型分析中染色体相对长度、臂指数和类型均按Levan的标准[4]，相对长度（relative length）=每个染色体长度/单倍染色体总长度，臂指数（arm index）=长臂长度/短臂长度，着丝粒指数（centromere index）=短臂长度/该染色体总长。臂指数1.0-1.7为中部着丝粒染色体（m），臂指数1.7-3.0亚中部着丝粒染色体（sm），臂指数在3.0-7.0之间的为亚端部着丝粒，臂指数> 7.0为端部着丝粒染色体（t）；着丝粒指数在50.0%～37.5%之间称中部着丝粒染色体（m）；着丝粒指数在37.5%～25.0%之间称亚中部着丝粒染色体（sm）；着丝粒指数在25.0%～12.5%之间称亚端部着丝粒染色体（st）；着丝粒指数在12.5%～0.0%之间称端部着丝粒染色体（t）；相对长度> 9 %的为大型染色体组，相对长度< 7 %的为小型染色体组。

3 结果与分析

3.1 青蛙骨髓细胞染色体核型

青蛙脊髓细胞中期染色体形态（见图1），然后用魔术棒将每个染色体选取后粘贴到新的文件中，每个染色体一个图层。用变换、旋转工具让染色体旋转到长臂朝下，短臂朝上。分别通过各个图层的选择排布最后将26个染色体按长度由大到小排队，最后直接在计算机上输出核型图片（见图2）。

图1 青蛙骨髓细胞染色体中期分裂相

图2 青蛙骨髓细胞染色体核型（Photoshop处理）

3.2 染色体核型分析数据统计

利用量尺工具计算每条染色体的短臂长、长臂长、总长等数据根据获得的数量，将对应的染色体进行一一配对。当所有染色体位置都摆放妥当后，编号1～13，合并所有图层并输出图片获得完整的核型分析图。

表1 青蛙骨髓细胞染色体核型数据

组别编号短臂长度长臂长度染色体全长相对长度臂指数着丝粒指数着丝粒位置Ⅰ 1 19.421.941.314.47 1.13 46.97m

Ⅰ 2 14.620.535.112.30 1.40 41.60m

Ⅰ 3 9.419.829.210.23 2.11 32.19sm

Ⅰ 4 11.217.128.39.92 1.53 39.58m

Ⅰ 5 9.216.525.79.00 1.79 35.80sm

Ⅱ 6 5.413.318.7 6.55 2.46 28.88sm

Ⅱ7 610.816.8 5.89 1.80 35.71sm

Ⅱ8 7.59.316.8 5.89 1.24 44.64m

Ⅱ9 7.39.416.7 5.85 1.29 43.71m

Ⅱ10 5.89.815.6 5.47 1.69 37.18m

Ⅱ11 68.314.3 5.01 1.38 41.96m

Ⅱ12 4.59.514 4.91 2.11 32.14sm

Ⅱ13 5.47.512.9 4.52 1.39 41.86m

表1列出了青蛙骨髓细胞的中期染色体的测量数据，即染色体的相对长度、臂指数和着丝粒指数，其中短臂、长臂长度为一对同源染色体的平均值。根据以上统计结果可知：青蛙骨髓细胞二倍体染色体数目为26个，共13对，核型公式为：K(2n)=26=13n =16m+10sm，未分析性染色体。

按照染色体的相对长度和着丝点指数，可以把全部染色体分为为大型和小型两类，故分为Ⅰ、Ⅱ二组。