蛋白质分离策略

蛋白质分离方法
摘要：本文介绍了蛋白质分离的一系列方法。

浸提，超声波破碎，研磨等原料预处理方法。

蛋白质粗提纯中的盐析，透析，超滤等方法。

层析法中的离子交换层析，凝胶层析，亲和层析用于蛋白质初提纯。

精提纯主要是使用电泳技术，如等电聚焦，DSD-PAGE，毛细管电泳，以及高效液相色谱法。

一、原料的预处理
在对蛋白质分离前，首先要对所要分离的原料进行分析。

要根据分离纯化原料不同而采取不同的预处理方法。

如果是富蛋白，或者液体原料，如血清，蛋清，蛇毒，蝎毒等，无需进行原料预处理，直接进行蛋白质的粗提取和富集；如果是动物材料，如肉，表皮等，要去掉结缔和脂肪组织；对于植物组织和细菌要将细胞壁进行破壁处理。

对原料的预处理不仅要把蛋白质从原来组织中释放出来，而且要保持蛋白质原有的天然状态。

为了防止蛋白质变性，溶解蛋白质的溶液一般为蛋白质缓冲溶液，缓冲溶液主要有，NaAc-HAc[1]溶液，PBS-NaCl[2][3]，
NaH
2PO
4
-Na
2
HPO
4
[4]缓冲溶液，Tris-HCI缓冲溶液[5]，缓冲溶液不仅可以保持蛋白质活性，还
可以作为浸提液提取蛋白质。

预处理的主要方法有浸提法，超声破碎法、研磨法、高压挤压法以及酶处理法[6]。

1.1浸提法
浸提是最常用的一种溶解蛋白质的方法，主要原理是利用蛋白质在溶液中具有一定溶解度，溶解于溶液中，达到蛋白质与原料（通常是固体）的分离。

浸提液主要有，水，去离子水或超纯水，提取水溶性蛋白质；盐，一般是NaCl，提取盐溶性蛋白质：醇，如乙酸[7]，正
丙醇，提取醇溶蛋白；弱酸，如乙酸[8]，弱酸性缓冲溶液，如PH6.0 NaH
2PO
4
-Na
2
HPO
4
缓冲溶
液，提取弱酸溶性蛋白质；弱碱，主要是碱NaOH[9]或弱碱性缓冲溶液，如PH8.5
KH
2PO
4
-Na
2
HPO
4
[10]，缓冲溶液，提取弱碱溶性蛋白质。

其他浸提液，如1.0mol/L盐酸胍与含
有0.02%EDTA的MES溶液浸提鲨鱼软骨[11]。

浸提法简单，方便，但要根据所分离的蛋白质的特点，配制浸提液时要保证蛋白质活性，严格控制浸提液的温度以及酸碱度。

1.2 超声破碎法
超声破碎的原理是利用电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的像小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。

生物上主要是使用超声波细胞破碎仪来对细胞进行破碎，特别是对植物细胞[5]
和菌[12]的细胞壁进行破碎。

1.3 破碎法
破碎法主要是将原料破碎，扩大原料表面积，提高蛋白质的溶解效率，原料的破碎也有利于释放出原料中的蛋白质。

主要有机械破碎法和研磨法。

机械法破碎使用的仪器，匀浆机，营养调理机[5]，高速组织捣碎机[13]。

研磨法主要使用研钵进行研磨。

机械破碎或研磨破碎时产生一定热量，可能会导致蛋白质变性，因而研磨时需要进行预冷处理，如加入液氮，冰块，冰丙醇[14]，或者原料、溶液预冷处理。

为了保持蛋白质活性，可加入蛋白酶抑制剂。

顾鹏毅[15]在分离牛脑中的海马组织中的NGF时，使用匀浆机对取出的海马结构破碎时，加入蛋白酶抑制剂，保持蛋白质活性，加入自制的冰，防止温度过高破坏蛋白质活性。

林文芳[16]等研磨0.5g芦苇叶片时加入2.5mL预冷研磨提取液（8mol/L尿素，20mmol/L DDT，2.%NP-40）研磨匀浆后离心。

破碎法使用仪器简单，成本低。

由于蛋白质易变性，需要严格控制破碎的条件，比如温度，蛋白质提取液的酸碱度等。

1.4酶处理法
酶处理方法就是利用酶使与其他物质结合的目标蛋白质释放出来。

张玉香等在对酵母的甘露糖蛋白进行分离纯化时，利用酶将结合于细胞壁中的甘露糖蛋白释放出来[1]。

一般条件下，酸性蛋白、酶、肽在碱性环境中较酸性环境中稳定，反之亦然。

在利用酶处理时，要考虑处理的条件，防止酶失效，提高提纯效果。

蓝泽林[17]在提取鸡蛋黄蛋白的时候，40℃酶反应器中加盐酸调节pH到3，加入酸性蛋白酶，反应完后，加入NaOH，调节pH到10，加入碱性蛋白，反应完，取最下层蛋黄蛋白溶液。

1.5离心
离心是分离液体和固体物质的一种非常有效的方法。

在分离蛋白质时，若蛋白质溶于溶液中，则离心后取其上清液；若蛋白质沉淀下来，则离心后取其沉淀。

由于蛋白质高温时变性或分解，离心时，溶液的温度会随着离心而升高，因而可选用带制冷系统的离心机，如冷冻离心机。

实验室分离蛋白质一般使用转速20000rpm以下的高速冷冻离心机。

二、蛋白质的粗提取和富集。

蛋白质在溶液中具有一定溶解性，而溶解的蛋白质会因为中性盐如硫酸钠，硫酸铵浓度增大而沉淀下来，这种沉淀是可逆的，由此发展了盐析法沉淀富集蛋白质；蛋白质也会在酸碱，如三氟乙酸（tca），丙酮，等条件下变性沉淀，依此原理发展了TCA沉淀法以及丙酮沉淀法。

而收集这些蛋白质沉淀，一般使用透析和超滤，以及离心法。

2.1 盐析
盐析，是利用蛋白质在某些盐，如(NH
4)
2
SO
4
中可变性沉淀，除盐后又复性溶解的原理进
行蛋白质与糖醛等有机物的分离。

盐析主要是通过一定饱和度的(NH
4)
2
SO
·
溶液是原料中的蛋
白质析出，离心分离得到沉淀蛋白。

如詹玲[3]分离大豆糖蛋白时，探索了硫酸铵饱和度分别为30%，40%,，50%，60%，70%，80%，90%时的蛋白质提取效果，最终确定70%时是最佳的盐析浓度。

还可以通过配置不同浓度的硫酸铵饱和溶液粗分离不同饱和度下开始沉淀的蛋白质。

2.2透析和超滤
盐析后，用Tris等缓冲溶液将盐析得到的沉淀蛋白质溶解，然后溶液装入透析袋中进行除盐处理，除去蛋白质中的盐。

透析袋可以允许小分子透过透析袋进入透析介质中，而不允许蛋白质等大分子通过，因而无机小分子不断被稀释，而蛋白质大分子确仍保留在透析袋中。

张冬梅[5]分离地鳖虫纤溶活性蛋白时，盐析、离心得到沉淀蛋白，Tris-HCl缓冲溶液溶解后，使用透析袋透析除盐。

蛋白质装于透析袋中（不超过透析袋1/3体积），用纯净水做透析介质，用氯化钡检测透析是否完全。

开始每隔3h换一次水，直至用氯化钡溶解到透析介质中不出现沉淀，结束透析。

盐析与透析结合提取蛋白质的方法，原料易得便宜，操作容易，而且可以防止蛋白质变性，避免引入其他污染物。

缺点是，盐析和透析时间相对较长，而且只能处理量比较大的蛋白质，少量蛋白质的提取操作比较困难。

盐析缓冲溶液溶解后的蛋白质也可以使用超滤的方法提取蛋白质。

超滤(Ultra Filtration，简称UF)以超滤膜作为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的溶质进行选择性分离。

超滤过程一般是在常温低压下进行的，对分离热敏性、保味性和易发生化学变化的物质最为适用。

超滤是一种广泛应用于分离纯化溶液中胶体和大分子蛋白质的分离技术。

超滤能截留蛋白质、多糖等相对分子质量大于1000Da的大分子及胶体，形成浓缩液，达到蛋白质分离及浓缩的目的。

虽然，超滤也只能处理大量的蛋白质，但与透析相比，超滤所需的时间比透析少，效率高于透析。

只是，超滤需要特殊仪器，如超滤杯，成本较高，而且操作较为繁琐。

万顺刚[18]提取鸡蛋中蛋黄ACE抑制肽时，使用的是双工位平板膜超滤设备，滤膜选择截留分子量为10kDa和3.5kDa的滤膜。

杨娟[19]用自制微型膜分离器分离鸡蛋中卵黄免疫球蛋白，滤膜选择100-kDa PES膜。

张希春[20]等分离蚯蚓的两种抗菌肽时，使用超滤杯系统进行过滤分离。

超滤和透析这些膜分离技术也存在一些不足，例如膜易污染等缺陷，在进行超滤，透析
之前，原料要经过一定的预处理，如絮凝、重力沉降、机械过滤、微滤等[17]。

2.3丙酮沉淀法和三氟乙酸/丙酮沉淀法
对于少量，不易得的蛋白质样品，如生物体液等，用盐析法沉淀会导致蛋白质的丢失，无法有效获得所需蛋白质。

可以利用蛋白质在丙酮，或者三氟乙酸（TCA）中变性沉淀这一方法将蛋白质沉淀下来，而这种变性是不可逆的。

TCA与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用:①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐.
②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀.③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显。

龙峰[21]探讨了TCA与丙酮沉淀脑脊液对双向电泳的影响时发现，TCA/丙酮处理后的脑脊液的蛋白质点数为342个，而单丙酮处理后的蛋白质点数为276个。

因而TCA/丙酮处理脑脊液样品略优于单丙酮处理。

三、蛋白质初提纯
蛋白质粗提纯主要是将沉淀分离得到的蛋白质进一步进行浓缩，将不同蛋白质分离开来，并对蛋白质进行除盐等处理。

3.1 离子交换柱层析
蛋白质具有等电点（pI,isoelectric point），在等电点pl这一pH值处，蛋白质所带静电荷为零；溶液pH值高于等电点，带负电荷，低于pH，带正电荷。

不同蛋白质等电点不同，基于蛋白质这一特点，可以使用离子交换层析对分离不同蛋白质。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

离子交换剂主要有以下三种：
1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。

2.交联葡聚糖离子交换剂：常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。

阴离子交换剂有DEAE-Sephadex A-25，A-50和QAE- Sephadex A-25，A-50；阳离子交换剂有CM-Sephadex C-25，C-50和Sephadex C-25，C-50。

阴离子交换剂用英文字头A，
阳离子交换剂的英文字头是C。

英文字后面的数字表示Sephadex型号。

3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在Sepharose CL-6B上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。

以下是离子交换树脂在蛋白质分离中的应用。

表1离子交换树脂纯化蛋白质
由上表可以看出，离子交换层析洗脱液可以是NaCl的浓度梯度洗脱，也可以使用Tris 缓冲溶液进行洗脱。

而纤维素，葡聚糖，琼脂糖三种离子交换剂都较为广泛使用。

离子交换层析，作为蛋白质的初提纯技术，使用方便，仪器简单，易操作，成本较低，使用的离子交换剂为生物型凝胶，不会对蛋白质造成污染，有利于保持蛋白质活性，因而广泛用于凝胶层析，电泳的上游分离技术。

但离子交换层析，交换剂填柱子，平衡操作时间较长，洗脱时间长，要防止洗脱时间过长导致蛋白质降解。

3.2 凝胶过滤色谱层析
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又被称为凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

凝胶柱主要是由凝胶珠装填到而成，每个凝胶珠都是类似于“筛子”，具有一定孔径筛孔。

小于平均孔径小分子蛋白质可以穿过珠子内部，这样造成小分子蛋白的走过的路径变长，而且珠子内部的阻力大，所以洗脱时间长。

而大分子蛋白质直接从孔隙间流过，直接被洗脱出来。

因而不同分子量的蛋白质得以分离开来。

凝胶珠材料主要是葡聚糖，常见有两大类，商品名为商品名分别为Sephadex 和Sephacryl。

Sephadex 的主要型号是G-10 ~ G-200，后面的数字是凝胶的吸水率(单位是mL / g 干胶)乘以10。

如Sephadex G-50，表示吸水率是5mL/g 干胶。

下表为Sephadex系列分离柱的有关参数及其应用：
表2 Sephadex系列分离柱的有关参数及其应用
Sephacryl 是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成。

是一种比较新型的葡聚糖凝胶。

Sephacryl 的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex 的范围。

所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。

⑴除盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。

⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。

⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。

测定未知物质的分子量时，在相同条件下洗脱，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。

⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

下表是凝胶层析在蛋白质中的一些应用。

表3 凝胶色谱在蛋白质中的应用
由上表可以看出，凝胶层析所用的洗脱液一般为弱碱性缓冲溶液，较常使用的的是型号为G-50,G-75，分离要求较高的时候使用分离范围更大的G-200。

结合离子交换层析，不难看出，凝胶层析可以用于分离离子交换层析后得到的更纯蛋白质，如，大豆，鸡蛋黄，血清等的蛋白质提取。

而蜈蚣的抗肿瘤蛋白的提取更是使用了凝胶-层析-凝胶的提取方式对蛋白质进行提纯。

凝胶色谱常用于分离蛋白质的精分离，可以分离分子质量差值大于200的蛋白质。

它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。

但成本较高，条件苛刻，层析样品要先过滤里面的固体杂质，否则容易堵塞凝胶柱，使得柱子失效。

3.1.3亲和层析
亲和层析（affinity chromatography AC）是蛋白质纯化的一种重要的方法，它具有很高的选择和分离性能以及较大的载量。

只需要一步处理即可使某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来达到千倍以上的纯化并保持较高的活性，目前亲和层析技术被广泛的应用在蛋白质研究和制备领域，是分离纯化以及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具。

亲和层析分离蛋白质的原理是将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。

那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。

分离原理如下图：
图1 层析分离原理
亲和层析在蛋白质中的应用主要分为生物特异亲和层析和人工配体亲和层析[32]。

1生物特异亲和层析
生物特异亲和层析用于蛋白质分离的主要有：免疫亲和层析（IAFC）和凝集素亲和层系（LAFC）。

免疫亲和层析是利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点，用适当的方法将抗原或抗体结合到层析载体上，便可有效的分离和纯化各自互补的免疫物质。

单克隆抗体技术的出现极大地推动了免疫亲和层析技术的发展。

只要得到特定单抗，利用其作为配体，通过亲和层析，即可从复杂的混合物中分离，纯化特定抗原成份。

McEl hiney 等固定单链抗体在载体上，用免疫亲和层析的方法从水中浓缩了蓝细菌分泌的微藻素，回收率达到94 %[33].
凝集素是一类糖结合蛋白，最先是由植物中分离到的，它可与蛋白的寡糖部分特异结合。

不同的凝集素能够特异地结合某种寡糖或者糖肽，因而可以借助于凝集素亲和层析对一些寡糖或糖肽进行结构分析，且具有特异、敏感、快速的特点，使得凝集素成为糖链结构分析的一种常用工具[34-37].更重要的是，该技术可用于分离糖基化的蛋白，对于几乎所有膜蛋白，这项技术都是极其有用的。

目前，可用的凝集素有数百种之多，常用于亲和层析的凝集素主要有麦胚凝集素（WGA）和伴刀豆凝集素A （Con A）。

麦胚凝集素特异结合β-N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸，伴刀豆凝集素A特异结合a- 甘露糖，a- 葡萄糖和a-N-乙酰葡萄糖胺。

另
一种较为常用的是对乙酰氨基葡萄糖专一的曼陀罗凝集素，可用于多巴胺D2受体的提纯[38]。

生物特异亲和层析具有很高的选择性，以及因为所用的配体为生物分子，可以很好地保持蛋白质的活性，但是配体有效固定到载体中却是很困难，不具有通用性，因而其载体和配体只能在极窄的领域使用。

2人工配体亲和层析
人工配体亲和层析也称为通用配体亲和层析,是指利用一些人工配体对不同的蛋白质有亲和性的特点,通过亲和层析来纯化这些蛋白质的方法。

主要包括金属螯合亲和层析和染料配体亲和层析等。

金属螯合亲和层析也称固相化金属离子亲和层析，该方法是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。

这些氨基酸残基包括组氨酸.色氨酸.赖氨酸等。

目前采用的固定金属离子螯合剂主要有亚氨基二乙酸（I DA）和次氨基三乙酸（TA）两种。

它们都可以有效地与Ni2+，Zn2+,Cu2+和Co2+等二价金属离子发生螯合作用,从而将这些金属离子固定在载体上。

刘尚义[39]等用Ni-NTA琼脂糖凝胶提取猕猴血清中的重组人内皮素。

金属螯合亲和层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和通用性强等特点。

由于该方法几乎对蛋白质本身的生物活性没有依赖，所以，除了可以在常规的非变性条件下进行纯化外还特别适合分离纯化变性蛋白，尤其是带6个组氨酸标签的重组蛋白。

广泛应用于大肠杆菌表达包涵体蛋白质的分离及纯化，是分离纯化生物工程蛋白质产品最有效的工具之一。

但是，金属螯合亲和层析在保持蛋白质活性稍差一些，而且金属离子可能会污染蛋白质，对于金属蛋白，分离后的鉴定有一定干扰。

而且，金属螯合亲和层析载体大都采用琼脂糖而琼脂糖颗粒表面较为粗糙，容易产生一些非特异性吸附现象。

尤其在分离小量蛋白或含疏水性蛋白较多时，非特异性吸附出现尤为普遍。

而且也不适应快速分离蛋白，大大影响了金属螯合层析的分离效果。

染料配体亲和层析所用的染料主要有两类一类是Cibacron 另一类是Procion 这些染料结构中都有三嗪环，环上有 1 ～2 个可被取代的氯原子。

三嗪环可与羟基反应偶联到载体上，在它们之间形成醚键。

染料的结构类似于某些酶类的底物，如Ci bacron Blue F3GA 与NAD的分子结构类似，它是许多酶和蛋白质的极有效的吸附剂，是纯化脱氢酶、激酶、血清蛋白、干扰素、多种血浆蛋白等极好的配体[40].
与其它人工配体亲和层析技术相比,普通的染料亲和层析也存在着非特异性吸附,选择性不够高的缺点.
总之，亲和层析具有特异性好，选择性高的特点，是一种很好的分离提纯蛋白质的工具。

但亲和色谱也具有局限性，如生物特异亲和层析的配体如何偶联到柱子上，还有偶联后遇到各式的蛋白质，如何保证蛋白质的活性；人工配体亲和层析中存在的微量染料和金属会不会对机体造成损害。

这些都制约了亲和层析的发展。

3.2密度梯度离心法
密度梯度离心法，可以分离像蛋白质这样沉降系数接近的物质。

这种方法使用一种密度能形成梯度（在离心管中，其密度从上到下连续增高）又不会使所分离的生物活性物质凝聚或失活的溶剂系统，离心后各物质颗粒能按其各自的比重平衡在相应的溶剂密度中形成区带。

常用的密度梯度溶剂是蔗糖或氯化铯（CsCl）溶液。

用蔗糖时，先将蔗糖溶液制成密度梯度溶液，再在其顶端加样品。

离心后，如欲收集所分离的组分，可在离心管的下端刺一小洞，然后分部收集。

如用CsCl这种密度大又扩散迅速的溶剂系统时，可将样品均匀地混合于溶剂中。

离心达到平衡后， CsCl溶液形成密度梯度，样品中各组分也在相应密度处形成区带。

四、蛋白质精提纯
4.1 电泳
溶液中带电的分子能够在电场中进行迁移，这种现象叫做电泳（electrophoresis）。

由于溶解的蛋白质带净电荷，而不同蛋白质有不同的电荷密度（电荷与质量的比率），会按照不同的速率向相应的电极进行迁移，所以理论上溶液中的蛋白质化合物可以通过电泳分离。

但是，由于外界因素的影响，很难在溶液中做标准电泳，而且当电场消失时，电泳形成的窄蛋白质区带很容易扩散变宽而导致蛋白质的重新混合。

在使用固定相基质电泳时，结束后分离的蛋白质就会被固定住，所以在很窄小的管子（如毛细管电泳）或像纸或凝胶这样的稳定基质进行电泳就可以将这些影响降到最低。

4.1.1等电聚焦
蛋白质具有等电点，等电点处蛋白质净电荷为零。

等电聚焦就是依据蛋白质所带电荷来对蛋白质进行分离。

其原理是：蛋白质在pH梯度中电泳时，蛋白质会移到pH值等于它的等电点的位置，此时蛋白质净电荷为零。

蛋白质在向等电点移动过程中电荷量密度会逐步降低。

达到等电点时，蛋白质电荷密度为零并停止运动。

IPG胶是等电聚焦最常使用电泳胶，已经成为蛋白质组学标准之一。

IPG凝胶在加电场前就已经建立好了pH梯度，并且在进行长时间的电泳后仍然可以保持稳定。

既简化了等电聚焦的使用方法，又确保电泳结果的可重复性。

等电聚焦电泳根据等电点分离等电点不同的蛋白质，是蛋白质电泳的一大发展方向，但很少单独使用。

原因主要有，1，蛋白质的多种多样，未知蛋白质的等电点跨度很大，IPG。