蛋白质分离策略

蛋白质分离方法

摘要：本文介绍了蛋白质分离的一系列方法。浸提，超声波破碎，研磨等原料预处理方法。蛋白质粗提纯中的盐析，透析，超滤等方法。层析法中的离子交换层析，凝胶层析，亲和层析用于蛋白质初提纯。精提纯主要是使用电泳技术，如等电聚焦，DSD-PAGE，毛细管电泳，以及高效液相色谱法。

一、原料的预处理

在对蛋白质分离前，首先要对所要分离的原料进行分析。要根据分离纯化原料不同而采取不同的预处理方法。如果是富蛋白，或者液体原料，如血清，蛋清，蛇毒，蝎毒等，无需进行原料预处理，直接进行蛋白质的粗提取和富集；如果是动物材料，如肉，表皮等，要去掉结缔和脂肪组织；对于植物组织和细菌要将细胞壁进行破壁处理。对原料的预处理不仅要把蛋白质从原来组织中释放出来，而且要保持蛋白质原有的天然状态。为了防止蛋白质变性，溶解蛋白质的溶液一般为蛋白质缓冲溶液，缓冲溶液主要有，NaAc-HAc[1]溶液，PBS-NaCl[2][3]，

NaH

2PO

4

-Na

2

HPO

4

[4]缓冲溶液，Tris-HCI缓冲溶液[5]，缓冲溶液不仅可以保持蛋白质活性，还

可以作为浸提液提取蛋白质。

预处理的主要方法有浸提法，超声破碎法、研磨法、高压挤压法以及酶处理法[6]。

1.1浸提法

浸提是最常用的一种溶解蛋白质的方法，主要原理是利用蛋白质在溶液中具有一定溶解度，溶解于溶液中，达到蛋白质与原料（通常是固体）的分离。浸提液主要有，水，去离子水或超纯水，提取水溶性蛋白质；盐，一般是NaCl，提取盐溶性蛋白质：醇，如乙酸[7]，正

丙醇，提取醇溶蛋白；弱酸，如乙酸[8]，弱酸性缓冲溶液，如PH6.0 NaH

2PO

4

-Na

2

HPO

4

缓冲溶

液，提取弱酸溶性蛋白质；弱碱，主要是碱NaOH[9]或弱碱性缓冲溶液，如PH8.5

KH

2PO

4

-Na

2

HPO

4

[10]，缓冲溶液，提取弱碱溶性蛋白质。其他浸提液，如1.0mol/L盐酸胍与含

有0.02%EDTA的MES溶液浸提鲨鱼软骨[11]。

浸提法简单，方便，但要根据所分离的蛋白质的特点，配制浸提液时要保证蛋白质活性，严格控制浸提液的温度以及酸碱度。

1.2 超声破碎法

超声破碎的原理是利用电能通过换能器转换为声能，这种能量通过液体介质而变成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的像小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。生物上主要是使用超声波细胞破碎仪来对细胞进行破碎，特别是对植物细胞[5]

和菌[12]的细胞壁进行破碎。

1.3 破碎法

破碎法主要是将原料破碎，扩大原料表面积，提高蛋白质的溶解效率，原料的破碎也有利于释放出原料中的蛋白质。主要有机械破碎法和研磨法。机械法破碎使用的仪器，匀浆机，营养调理机[5]，高速组织捣碎机[13]。研磨法主要使用研钵进行研磨。机械破碎或研磨破碎时产生一定热量，可能会导致蛋白质变性，因而研磨时需要进行预冷处理，如加入液氮，冰块，冰丙醇[14]，或者原料、溶液预冷处理。为了保持蛋白质活性，可加入蛋白酶抑制剂。顾鹏毅[15]在分离牛脑中的海马组织中的NGF时，使用匀浆机对取出的海马结构破碎时，加入蛋白酶抑制剂，保持蛋白质活性，加入自制的冰，防止温度过高破坏蛋白质活性。

林文芳[16]等研磨0.5g芦苇叶片时加入2.5mL预冷研磨提取液（8mol/L尿素，20mmol/L DDT，2.%NP-40）研磨匀浆后离心。破碎法使用仪器简单，成本低。由于蛋白质易变性，需要严格控制破碎的条件，比如温度，蛋白质提取液的酸碱度等。

1.4酶处理法

酶处理方法就是利用酶使与其他物质结合的目标蛋白质释放出来。。张玉香等在对酵母的甘露糖蛋白进行分离纯化时，利用酶将结合于细胞壁中的甘露糖蛋白释放出来[1]。一般条件下，酸性蛋白、酶、肽在碱性环境中较酸性环境中稳定，反之亦然。在利用酶处理时，要考虑处理的条件，防止酶失效，提高提纯效果。

蓝泽林[17]在提取鸡蛋黄蛋白的时候，40℃酶反应器中加盐酸调节pH到3，加入酸性蛋白酶，反应完后，加入NaOH，调节pH到10，加入碱性蛋白，反应完，取最下层蛋黄蛋白溶液。

1.5离心

离心是分离液体和固体物质的一种非常有效的方法。在分离蛋白质时，若蛋白质溶于溶液中，则离心后取其上清液；若蛋白质沉淀下来，则离心后取其沉淀。由于蛋白质高温时变性或分解，离心时，溶液的温度会随着离心而升高，因而可选用带制冷系统的离心机，如冷冻离心机。实验室分离蛋白质一般使用转速20000rpm以下的高速冷冻离心机。

二、蛋白质的粗提取和富集。

蛋白质在溶液中具有一定溶解性，而溶解的蛋白质会因为中性盐如硫酸钠，硫酸铵浓度增大而沉淀下来，这种沉淀是可逆的，由此发展了盐析法沉淀富集蛋白质；蛋白质也会在酸碱，如三氟乙酸（tca），丙酮，等条件下变性沉淀，依此原理发展了TCA沉淀法以及丙酮沉淀法。而收集这些蛋白质沉淀，一般使用透析和超滤，以及离心法。

2.1 盐析

盐析，是利用蛋白质在某些盐，如(NH

4)

2

SO

4

中可变性沉淀，除盐后又复性溶解的原理进

行蛋白质与糖醛等有机物的分离。盐析主要是通过一定饱和度的(NH

4)

2

SO

·

溶液是原料中的蛋

白质析出，离心分离得到沉淀蛋白。如詹玲[3]分离大豆糖蛋白时，探索了硫酸铵饱和度分别为30%，40%,，50%，60%，70%，80%，90%时的蛋白质提取效果，最终确定70%时是最佳的盐析浓度。还可以通过配置不同浓度的硫酸铵饱和溶液粗分离不同饱和度下开始沉淀的蛋白质。

2.2透析和超滤

盐析后，用Tris等缓冲溶液将盐析得到的沉淀蛋白质溶解，然后溶液装入透析袋中进行除盐处理，除去蛋白质中的盐。透析袋可以允许小分子透过透析袋进入透析介质中，而不允许蛋白质等大分子通过，因而无机小分子不断被稀释，而蛋白质大分子确仍保留在透析袋中。张冬梅[5]分离地鳖虫纤溶活性蛋白时，盐析、离心得到沉淀蛋白，Tris-HCl缓冲溶液溶解后，使用透析袋透析除盐。蛋白质装于透析袋中（不超过透析袋1/3体积），用纯净水做透析介质，用氯化钡检测透析是否完全。开始每隔3h换一次水，直至用氯化钡溶解到透析介质中不出现沉淀，结束透析。

盐析与透析结合提取蛋白质的方法，原料易得便宜，操作容易，而且可以防止蛋白质变性，避免引入其他污染物。缺点是，盐析和透析时间相对较长，而且只能处理量比较大的蛋白质，少量蛋白质的提取操作比较困难。

盐析缓冲溶液溶解后的蛋白质也可以使用超滤的方法提取蛋白质。超滤(Ultra Filtration，简称UF)以超滤膜作为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的溶质进行选择性分离。超滤过程一般是在常温低压下进行的，对分离热敏性、保味性和易发生化学变化的物质最为适用。

超滤是一种广泛应用于分离纯化溶液中胶体和大分子蛋白质的分离技术。超滤能截留蛋白质、多糖等相对分子质量大于1000Da的大分子及胶体，形成浓缩液，达到蛋白质分离及浓缩的目的。虽然，超滤也只能处理大量的蛋白质，但与透析相比，超滤所需的时间比透析少，效率高于透析。只是，超滤需要特殊仪器，如超滤杯，成本较高，而且操作较为繁琐。

万顺刚[18]提取鸡蛋中蛋黄ACE抑制肽时，使用的是双工位平板膜超滤设备，滤膜选择截留分子量为10kDa和3.5kDa的滤膜。杨娟[19]用自制微型膜分离器分离鸡蛋中卵黄免疫球蛋白，滤膜选择100-kDa PES膜。张希春[20]等分离蚯蚓的两种抗菌肽时，使用超滤杯系统进行过滤分离。

超滤和透析这些膜分离技术也存在一些不足，例如膜易污染等缺陷，在进行超滤，透析