第六章 化学毒物的一般毒性作用-亚慢性和慢性毒性

系统尸检和组织病理学检查
脏器称重和脏器系数（relative organ weight）：又称脏器相对重量， 指脏器湿重与单位体重的比值，通常是每100g体重中某脏器所占质量， 表示为脏器质量(g)/体重(100g)。
脏器适用于实质性脏器，包括：心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、卵 巢等。 脏器系数增大表示该脏器肿大，病变可能是增生、充血、水肿； 脏器系数减小可能表示脏器发育不良或萎缩等变化。
生物半衰期法
（一）蓄积系数法
蓄积系数(accumulation coefficient)：指多次染毒使半数 动物出现某种效应的总量与一次染毒的半数效量之比值。 一般采用大鼠或小鼠，以死亡作为效应指标。 K=ED50(n)/ED50(1) 或 K=LD50(n)/LD50(1) ED50(n):以慢性方式多次接触受试物时产生预期效应的 累积剂量之和。 ED50(1):一次接触该物质产生相同效应的一次剂量。
④ 强蓄积性：1/20 LD50组有死亡，且有剂量反应关系。
（二）生物半衰期法
从上图可以看出，一种化学物质若以t1/2相等的时间间距染毒，其在体内经 过6个t1/2的接触期就可以基本上达到蓄积的极限，此时理论蓄积量达到极 限的98.4%，此后即使继续接触该物质，机体的蓄积量基本上也不会增加。
（１）t1/2的测定：当机体接触受试物后，测定不同时间体内 血浆中该物质的浓度。以时间ｔ作横坐标，血浓度Ｃ作纵坐 标，绘图，得一直线，从图中求消除速率常数Ｋe。
蓄积系数的评价
蓄积系数（Ｋ） 蓄积作用分级 <1 135高度蓄积 明显蓄积 中等蓄积 轻度蓄积
1. 固定剂量法
方法：
（1）急性毒性实验
LD50(1)
LD50(n)
（2）1/20-1/5LD50 每日染毒
（ 50%动物死亡时累计染毒的总量）
（3）计算K值：K=LD50(n)/LD50(1)
若累计染毒量已达到5个LD50，动物仍未死亡或死 亡未达到半数，可终止实验，其Ｋ值按 ＞５作为结果。

t1/2=0.693/Ke
（２）蓄积极限值的求得： 蓄积极限值＝1.44(常数)×每日给予量(吸收量)×半衰期 t1/2
第五节 短期、亚慢性和慢性毒性作用
一、基本概念
短期重复剂量毒性：实验动物或人连续接触外源化学物 14-30天所产生的中毒效应。
亚慢性毒性（subchronic toxicity）：实验动物或人连续 较长期接触外源化学物所产生的中毒效应。接触时间相 当于生命周期的1/10，通常为1-6个月。 慢性毒性（chronic toxicity）：实验动物或人长期（甚 至终生）反复接触外源化学物所产生的毒性效应。长期 一般是指实验动物的一生或一生中的大部分时间，至少 6个月以上，通常是24个月。
血液学检查：血红蛋白，红细胞、白细胞计数，白细胞 分类，血小板计数，凝血时间等，作为常规检查的项目。 血液生化检查：通常为血清天门冬氨酸氨基转移酶、丙 氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素 氮（BUN）、总蛋白（TP）、血糖（GLU）、总胆红素 （T-BIL）、肌酐(Crea)、总胆固醇（T-CHO）等。 尿液检查：包括外观、pH值、尿蛋白、尿糖、潜血及常 用血清尿素氮，尿蛋白定性、定量等。
第六章 外源化学物的一般毒性作用（二）
第四节 蓄积毒性作用及其评价
一、基本概念
外源化学物连续的反复的进入机体，而且进入机体的 吸收速度或总量超过了其代谢转化排出的速度或总量 时，化学物质就可能在体内逐渐的增加并贮留，这种 现象就称为化学物质的蓄积作用（accumulation）。 蓄积库（depot）：化学物蓄积的组织器官部位。常见 的蓄积库包括： 血浆蛋白 脂肪组织 肝脏、肾脏 骨骼
２. 递增剂量法
方法： （1）测定LD50(1)
（2）第1-4天，先给予0.1LD50(1)，以后每4天 递增剂量1.5倍
LD50(n) （3）计算Ｋ值。 28天时死亡动物仍未达到半数，可停止实验，此时的 总量达到12.8LD50(1)，即Ｋ＞12.8，可认为基本无蓄积。
３. 剂量固定的20天蓄积法
方法：分为1/2、1/5、1/10、1/20 LD50四个剂量组和对照 组，每组10只动物，每天染毒一次，共染毒20天，观察 每组动物死亡数量。 结果判定： ① 蓄积不明显：各剂量组均无死亡；

② 弱蓄积性：仅1/2 LD50组有死亡，其它剂量组无死亡；
③ 中等蓄积性：1/20 LD50组无死亡，其它各组间死亡数 有剂量反应关系；
化学物蓄积作用分类
物质蓄积：化学物在体内逐渐积累增多，用分析方法可 以检测出物质的原型或代谢产物。
损伤蓄积：又称功能蓄积，化学物长期接触后，机体内 虽然不能测出其原型或代谢产物，却出现了慢性毒性作 用的表现。
二、蓄积作用的研究方法
目的：通过蓄积试验求出蓄积系数K，了解化学 物蓄积毒性的强弱，并作为慢性毒性试验及其 它有关毒性试验的剂量选择提供参考。 蓄积系数法
经胃肠道染毒
大鼠、小鼠常采用灌胃法，保证染毒剂量的准确性。 猫、狗常采用胶囊法。 食品可首选将受试物混入饲料，让动物自行食入。 喂饲法应保证受试物稳定，在食物中混合均匀，受试物 掺入饲料的最大量规定： 30天试验不得超过10g/100g饲料 90天试验不得超过8g/100g饲料 慢性试验不得超过5g/100g饲料
Байду номын сангаас
年龄、性别和动物数
年龄：健康、年幼者，6～8周龄的大鼠、小鼠。小鼠 15-18g，大鼠70-100g，家兔约2kg，狗约8kg ，同组之 间平均体重相差不超过5%，单组动物体重不应超过平 均体重的10%。 性别：雌雄各半，特殊情况也可用单性。 动物数量：大、小鼠每组大于20只，犬、猴等大动物每 组大于6只。 分组：至少四组：三个剂量水平染毒（高、中、低）， 一个组作为对照（阴性对照）。
雄 性 大 鼠 体 重
(g) (g)
500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0周
空 高 中 低
3周
6周
9周
12周
15周
18周
21周
24周
27周
神经生长颗粒对大鼠体重的影响
食物利用率
动物每吃100g食物所增长的体重克数，表示为体重（g） /饲料（100g）。 喂饲染毒时，可计算实际染毒剂量。食物利用率可以鉴 别动物体重降低是由于进食减少，还是受试物毒作用。
经呼吸道染毒
经呼吸道染毒时间通常为每日2～6小时，可根据需要相 应延长或缩短。 一般亚慢性试验每天吸入4小时左右，按照实际情况间 歇性吸入或持续性吸入。
注射途径染毒
静脉注射途径染毒如果长期实施困难，可用腹腔 注射替代，长期反复腹腔注射应注意无菌操作。
观察指标
（1）一般性指标 ①外观体征 ②体重 ③饲料消耗量 ④中毒症状和死亡率 （2）实验室检查 ①血液学检查 ②血液生化检查 （3）系统尸检和组织病理学检查 ①脏器重量和脏器系数 ②病理学检查 （4）其他指标的检查 （5）可逆性观察
剂量分组
高剂量组：出现明显的典型的中毒症状和效应，或少量 动物的死亡（少于10%）。 中剂量组：出现轻微的可见的中毒症状，相当于观察到 有害作用的最低剂量（LOAEL）。 低剂量组：无中毒反应，相当于未观察到有害作用剂量 （NOAEL）。 对照组：往往用溶剂对照，其目的是为了排除动物在实 验期间随年龄的增加而发生的某些生理、生化的变化， 以及与受试物无关的疾病或死亡对实验的影响，同时也 可观察溶剂对实验动物的影响。
例如：大鼠喂饲溴甲烷熏蒸过的食物2个月，其体重平均增加 156.6g，而对照组大鼠平均体重增加180.9g，虽然前者体重增加 较慢，但接触组与对照组的食物利用率却基本相同（接触组为 25.2，对照组为25.6），说明大鼠长期食用溴甲烷熏蒸过的食物， 基本上不影响其对食物的吸收和利用，体重增长减慢可能是由 于食欲下降或其它原因所致。
物种和品系
一般要求两种实验动物，其中一种用啮齿类：大鼠、小 鼠；另一种用非啮齿类：兔、犬、猴等。选用动物的种 属和品系，应该是急性毒性试验已证明是对受试物敏感， 或用对受试物的吸收、分布、排泄及其它生物反应与人 类相近者。 品系：小鼠 NIH、ICR、C57BL/6J（B6）等 大鼠 Wistar、Sprague-Dawley（SD）等 犬 Beagle等
剂量设计依据
以相同物种的短期毒性资料为依据。亚慢性试验可依据 急性毒性试验的阈剂量为最高剂量，或1/5～1/20的LD50 的剂量。 对于人群主动摄入的药品或食品，可采用人体可能拟用 的最高剂量为设计依据。大鼠可用人临床拟用剂量的10、 30、100倍，兔、狗可用5、15、50倍。 当预期受试物没有明显毒性时，长期试验设计至少等于 人拟用剂量的最大倍数，保健品为100倍，中药为50倍， 化学药品为30倍。
六、长期毒性试验的结果评价
剂量相关趋势：最好的试验结果是最高剂量组中毒效应明显，中剂量 组有轻度表现，低剂量组无任何异常毒效应。 差异大小和性别差异：差异越大，更有关联；同时观察两种性别。 相关指标变化：处理组某项指标变化，伴随着相应的指标改变，这种 效应可能与处理有关。
反应重现性：重复性包括在研究中不同时间点、同一物种动物在其他 的独立研究中，或在另一个物种发生相同的异常。
历史性对照的作用：①可以识别异常的阴性对照；②可以更好的理解 低发生率的发现；判断是否在正常生物变异范围内；③如果指标变化 与对照组比较有统计学意义，但在历史对照范围内，该差异不能判断 为与受试物有关的效应。
统计学意义
？
生物学意义
实验动物的选择
（1）物种和品系 （2）性别、年龄和动物数 （3）微生物学寄生虫学等级和饲养环境
二、实验目的
观察长期接触受试物的毒性效应谱、毒作用特点和毒 作用靶器官，了解其毒性机制。
观察长期接触受试物毒性作用的可逆性。
研究重复接触受试物毒性作用的剂量-反应（效应）关 系，获取毒性作用参数，如NOAEL和LOAEL，为制 定人类接触的安全限值提供依据。
确定不同动物对受试物的毒效应的差异，为将研究结 果外推到人提供依据。
微生物学寄生虫学等级和饲养环境
在符合国家实验动物标准的试验环境中进行。动物给予 营养合理的饲料，洁净的饮水，清洁无污染的垫料和笼 具，人工控制昼夜交替，不同项目分室进行。 实验动物分级： 普通级 清洁级 无特定病原体级（SPF级） 无菌级
350
雌 性 大 鼠 体 重
300 250 200 150 100 50 0 0周 3周 6周 9周 12周 15周 18周 21周 24周 27周 空 高 中 低
三、亚慢性毒性试验方法的要点
＊1. 实验动物的选择 ＊2. 剂量设计与分组 ＊3. 染毒途径与时限 ＊4. 观察指标
四、慢性毒性试验方法的要点
＊1. 实验动物的选择 ＊2. 剂量设计与分组 ＊3. 染毒途径与时限 ＊4. 观察指标
五、长期毒性试验的注意事项
重视实验项目管理：选择经验丰富的专业人员对项目的设计和实施 进行管理，保证仪器设备状态良好，工作人员专业培训。 实验室环境的要求：注意动物饲养和试验环境的规范化，符合 GLP 。 检测条件的控制：必须具有标准操作规程， 仪器设备的稳定性，辅助条件的可靠性； 指标的测定要准确，方法先进、精密、可靠。 合理的实验设计：得到明确的剂量-反应关系，获得理想的LOAEL 和NOAEL。 重视试验前和对照组的检测： 实验前对动物预测观察指标进行正常值的测定，去除个体差异 较大的实验动物； 设立合理的对照组，观察指标应是对照组与实验组同时观察。
染毒途径与时限
应尽量模拟人类在环境中实际接触的方式和途径，同时 还必须与预期进行的慢性毒性试验的染毒途径相同。常 用的有：经胃肠道、经呼吸道、经皮肤接触。 染毒频率一般为每日一次，连续给予。在设计实验时要 注意定时、定量，使受试物在动物体内的血浓度能维持 稳态水平，保持受试物生物学效应每日相似性。一般为 每日上午进行，给药后喂食。