基因敲除技术

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2、TALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是 一种可靶向特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细 菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计 识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就 生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对 DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。
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2010
2010 2011
Zhang等设计了针对ADH1和TT4的ZFNs，并构建了雌性激素诱导表达的载体系统 Osakabe设计了针对ABA-INSENSITIVE4( ABI4) 基因的ZFNs，并用农杆菌介导转入拟南芥植株， 最终得到了ABI4基因敲除的纯合个体，具有对ABA和葡萄糖不敏感的表现型
Shaun等利用CoDA设计了8对ZFNs靶向操作大豆基因组中的独立基因与重复基因对
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ZFNs的优缺点：
锌指核酸酶ZFNs在植物基因组定点改造上的可能前 景，但由于ZFNs的合成组装技术难度大，一般实验室 难以实施，而且ZFNs易于对基因组进行非特异性切割， 或对靶点DNA切割效率低，一直限制其进入实际应用
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基因敲除步骤：
（1）分析和确定待改良性状及其目标基因
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（2）针对目标基因DNA序列构建1对（或多对）TALENs表达基因盒， 并将其装载入合适的植物表达载体。 （3）利用农杆菌介导法等遗传转化途径，将TALENs表达基因盒导入目 标植物细胞 （4）分化获得转TALENs基因植株 （5）对转基因植株进行剪切位点的DNA序列分析及目标基因的表达分 析 （6）对转基因植株进行表型检测，包括目标基因性状和其它主要农艺 性状 （7）转基因植株通过自交或与其它材料杂交，筛选剔除转入的外源 DNA片段、同时目标基因又得到修饰了的转基因植株 （8）与常规育种技术结合，培育剔除不利性状基因或激活目标基因的 植物新品种。
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1.锌指核酸酶(ZFNs) 2.TALENs 3.CRISPR-Cas9
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• 1、锌指核酸酶(zinc
finger nuclease, ZFNs) 又名锌指蛋白核酸酶，不是自 然存在的，而是一种人工改造 的核酸内切酶(图1)，由一个 DNA识别域和一个非特异性核 酸内切酶构成，其中DNA识别 域赋予特异性，在DNA特定位 点结合，而非特异性核酸内切 酶赋剪切功能，两者结合就可 在DNA特定位点进行定点断裂。
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基因定点敲除技术
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概念
基因敲除(knockout)技术是20世纪80年代发 展起来的。是指一种遗传工程基因修饰技术， 针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定的基 因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研 究可能进一步对相关生命现象造成的影响， 进而推测该基因的生物学功能。
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操作步骤：
第一步: 据靶序列设计RNA序列 第二步: 根据自身需要选择sgRNA表达载体构建，或sgRNA体外转录合成 第三步: 选择CRISPR/Cas9载体 第四步：sgRNA活性检测 第五步：稳定表达Cas9蛋白细胞株筛选
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优势：
(1)TALE的核酸识别单元与AGCT有恒定的对应关系 (2)靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的 任意靶序列。 (3)毒性低、脱靶情况少 (4)成对的TALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。
缺点:
模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司
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3.CRISPR-Cas9
2013 年 1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了 基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，一 种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9出现， 它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制 作简单、成本低、作用高效。
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2005
2005 2009 2009 2009 2009
利用农杆菌介导转基因拟南芥的研究，NHEJ修复ZFNs引起的DSB在植物基因工程中应用的 可能性 Wright 等在烟草中利用ZFNsHR诱发DSB，证明了HR修复ZFNs引起的DSB在植物基因工程中 应用的可能性 Maeder等首先利用NHEJ修复了由ZFNs介导的烟草SurA和SurB的基因敲除 Townsend等利用HR修复机制对SurA和SurB的基因进行了操作 Cai等利用ZFNs对烟草的CHN50基因进行了操作，他们利用HR介导的修复机制把PAT基因转 入CHN50序列中 Shukla等利用HR修复通过插入PAT基因来敲除玉米的IPK1基因，得到了插入PAT基 因并使 CHN50基因敲除的玉米材料并研究了该基因敲除后的植物代谢表现
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CRISPR( Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats) /Cas( CRISPR-associated) 系统是一种广泛存在于细菌与古细菌中的， 由RNA介导的可遗传的获得性免疫系统，这种免疫系统为宿主细胞 提供了对外源DNA( 如噬菌体质粒) 的免疫功能。 此系统的工作原理是 crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱 基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （short guide RNA ）， 足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。
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结构
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优缺点： 相比于传统的锌指核酸酶(ZFNs)技术，TALENs 具有独特的优势：设计更简单，特异性更高。缺点 有：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般 需要求助于外包公司。
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图1. 结合到DNA(橙色)上的锌指核酸酶(蓝色)， 图片来自维基共享资源，Thomas Splettstoesser
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结构
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利用ZFNs进行基因打靶的试验步骤
（1）确定ZFN靶位点的DNA序列 （2）设计和选择可识别靶位点的锌指蛋白( ZFPs) （3）利用已选择和设计的锌指蛋白组装ZFNs （4）单独将ZFNs转入正常细胞诱导目标基因发生DSB，则可激 活NHEJ修复机制，或许将ZFNs和与目标基因同源的供体DNA一 同转入正常细胞，则可以激活HR介导的DSB修复机制，并产生 出变异群体 （5）检测与研究供体DNA模板在特异位点所引起的基因变异与 基因修复情况 （6）还需要通过Southern杂交来检测供体DNA序列并没有整合 到细胞基因组的其他位点
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2011 2011 2012
Mahfouz等将TAL效应子Hax3的基因序列作了一些调整，在拟南芥和烟草叶片中实验，证 明TALENs能够在植物体内特异性地对靶基因序列进行定点剪切。 Cermak等通过拟南芥原生质体瞬时表达系统也证明TALENs在植物细胞内具有定点剪切功能。 Yang Bing博士及其同事利用TALENs技术成功地将水稻感病基因Os11N3启动子序列定点切割 使水稻白叶枯病原菌TAL效应子AvrXa7和PthXo3失去对Os11N3启动子靶点序列的识别，从 而提高水稻的抗病能力。
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CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统 和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。 首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。 其次，CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让 它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源 末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来 在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPRCas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成。
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2009年，Boch等和Moscou等关于黄单胞菌效应子蛋白TAL效应 子（transcription activator-like effector）与寄主靶基因DNA特异性识 别分子密码的破解，使植物基因组定点改造呈现出新的曙光。 2011年8月来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研 究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，并成功 敲除了人类细胞靶向基因和调控内源性基因的转录。 2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的 Kim课题组建立了一个全基因组规模的TALEN体系。他们系统地选取了 人类基因组中高度特异性的序列作为靶点以避开脱靶效应。通过高通量 克隆体系，一次性构建了近2万个编码蛋白基因的TALEN质粒。 2014年2月，北京大学生命科学学院魏文胜课题组依托于一种自主研 发的TALE蛋白组装技术完成了全部TALE元件的解码工作。