(林木育种学)第八章林木生物技术

（二）细胞培养与融合
1 原生质体分离
①材料的选择
②材料的预处理 预培养法 暗处理法 药物及添加物处理法 萎蔫处理法 更新培养基法
③原生质体分离
④原生质体的收集与纯化
⑤原生质体活力鉴定
3 原生质体培养
1）原生质体培养方法 液体浅层静止法 固体培养法 饲养法
2）原生质体培养基 KM、KM8P、V-KM等
3目的基因转化 1）农杆菌介导基因转化法 2）PEG转化法 3）电穿孔法（电激法） 4）基因枪法 5）花粉管通道导入法
4转化细胞的筛选与转基因植株鉴定 1）通过检测标记基因或报告基因： 标记基因：nptⅡ基因（新霉素磷酸转移酶基因）、amp（氨苄青霉素
抗性基因）、hyg（潮霉素磷转移酶基因）等。 报告基因：gus基因（B-葡萄糖苷酶基因）、luc（绿色荧光蛋白基因）、
3突变细胞的筛选方法
1）直接选择法：是指新的突变表型在选择条件下能够优先生长，或预期从 感官上可以测定其它可见的差异。可分为正选择和负选择两种方式。
正选择：指在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的化合物，使正常细胞不 能生长而只有突变体才能生长，从而筛选出细胞突变体。
负选择：指用特定培养基使突变体细胞处于不能生长状态，而非突变细胞却 可以正常生长，然后用汰选剂淘汰正常生长细胞，最后使突变细胞恢复生长并 分离出来。
缘种B. campestris杂交、回交后代的育性，结果发现杂种花粉的育性超
过90%，且有42%左右的植株抗除草剂等。
三 分子标记辅助育种 1 DNA遗传标记的特点：
数量极多； 遗传上稳定； 排除了环境差异。
2 DNA遗传标记的应用
构建遗传图谱； 分析亲缘关系； 定位目的性状； 分子标记辅助选择； 种质资源及杂种后代的鉴定。
nos（胭脂碱合成酶基因）等。
2）通过目的基因表达检测 ◆在转录水平上对特异mRNA进行检测
Northern杂交：包括斑点杂交及印迹杂交 ◆在翻译水平上对特异蛋白质进行检测
①生化反应检测法 ②免疫学检测法
免疫沉淀法 酶联免疫吸附法（ELISA） Western杂交 ③酶活性分析
基因枪法
（二）基因工程在林木育种中的应用 （1）抗虫基因工程 田颖川等（1993）将Bt基因转化欧洲黑杨，部分转基因植株
(10)花卉花色基因工程 花卉的颜色主要由类黄酮、类胡萝卜素及花青素决定。利用外源花青
素结构基因和调节基因进行遗传转化，大多花卉上实现了花色改变。 如科研人员将玉米DFR（4-黄烷酮醇还原酶）基因导入矮牵牛，创造出
了矮牵牛淡砖红色新品种系列。
(11)花卉香味基因工程 主要集中于单萜（一类重要的花香物质）的合成过程研究。Lis基因可
对杨尺蠖、舞毒蛾的杀虫率达到90%以上。 李 明 亮 等 （ 2000 ） 采 用 农 杆 菌 介 导 法 将 蛋 白 酶 抑 制 剂 基 因
（PI） 导入含Bt基因的欧洲黑杨，双抗转基因植株抗虫能力明显 高于仅含Bt基因的植株。
转BT基因提高火炬松抗虫能力
（2）抗病基因工程 包括抗病毒病、抗真菌病和抗细菌病基因。 英国牛津大学病毒所克隆杨树花叶病毒PMV外壳蛋白基因并转化杨
第八章 生物技术与林木育种
一 林木细胞工程
（一）概念
细胞工程：是指以细胞为单位，在体外进行培养、繁殖或人为地使细胞 某些生物学特性按人们的意愿加以改变，从而达到改良或创造新品种，加速 繁育生物个体，或获得某种有用物质的过程。
细胞工程应用于育种时，主要利用染色体数目与结构变异以及基因突变 等遗传变异类型。包括细胞融合与细胞突变体的筛选等。
刘 斌 等 （ 2002 ） 利 用 根 癌 农 杆 菌 介 导 将 反 义 磷 脂 酶 Dγ 基 因 （PLDγ）转入三倍体毛白杨，获得可在含0.7%NaCl的培养基质上 生长的转基因植株等。
（5）耐低温基因工程
（6）木素合成相关基因工程 将 香 豆 酸 CoA 连 接 酶 （ 4CL ） 、 肉 桂 酰 乙 醇 脱 氢 酶
草效率，降低生产成本。 Harcourt等（2000）用农杆菌介导法转化赤桉获得了抗高剂
量广谱除草剂Liberty的转基因植株，其实验剂量（6L/hm2）是 田间实际用量的两倍。
（4）抗盐碱基因工程 刘凤华等（2000）利用土壤农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢
酶（mtl-D）基因导入八里庄杨，经测试可在含0.4%NaCl的基质上 正常生长。
合成酶和ACC氧化酶是植物乙烯生物合成过程中的关键性酶，应用转基因 的方法抑制乙烯合成关键酶的活性可抑制乙烯的生成。
利用反义技术将ACC氧化酶或ACC合成酶基因的反义序列导入香石竹中， 转基因切花的寿命大大延长。
转基因改变表型—安全性研究
Decaffeinated coffee is now made by treating coffee beans to remove the caffeine.
4 细胞融合的应用 近缘植物原生质体融合→偶数或奇数多倍体 远缘植物原生质体融合→双二倍体
ห้องสมุดไป่ตู้
（三）细胞突变体的筛选
1概念与优势 细胞突变体：是指在植物细胞培养过程中，因基因或染色 体结构发生改变而产生的细胞及其再生植株特征与特性的遗 传变异。 与常规方法相比，细胞突变体诱导与筛选具有诱变处理的 群体大，筛选方便的优点。
2）间接选择法：是借助与突变表型有某种相关的特征 作为间接选择指标的选择方法。
如在离体培养细胞中直接选择抗旱性是较为困难的， 但可以通过选择抗脯氨酸类似物的突变细胞，从而间接筛 选出抗旱突变体。
二 基因工程
（一）概念
基因工程：就是按照人们预先设计的生物蓝图，应用人工方法将生物的 遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行分割、拼接和重组，进而将重 组DNA 导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性或获得某种基 因产物（多肽或蛋白），这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程， 或称为DNA重组技术。
（二）基因工程的操作步骤与方法
1 目的基因的分离 ◆基因工程常用的工具酶
（1）限制性内切酶 （2）DNA连接酶 （3）DNA聚合酶 ◆目的基因分离与获得方法 （1）直接分离目的基因（鸟枪射击法） （2）酶促合成目的基因（逆转录法） （3）化学合成目的基因
2构建基因工程载体 载体：携带外源基因进入受体细胞的工具。 理想的质粒载体应具备的条件： ①在宿住细胞中能独立复制； ②DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，外源基因插入其中可以象 载体正常组分一样进行复制和扩增； ③基因组中有1～2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的特性； ④分子量小，可多次复制，易于操作。
▼持续强选择压导致有害生物的协同进化 在实验室条件下，有甜菜夜蛾、烟芽夜蛾、粉斑螟、小菜蛾、欧洲玉米
螟、棉铃虫等多种昆虫经过6～19代筛选，抗性上升到70～500倍。 国内已有研究表明，棉铃虫对Bt农药与转Bt基因棉花品系间存在交互抗
性。 病虫抗性进化的实质就是环境压力对基因的选择，主要是通过基因突变
树，育成抗病无性系。 Nicolescu（1996）将矮牵牛黄酮合成酶（GHSA）基因导入杨树，
提高了抗病性。 赵世民等（1999）将兔NP-1防御素基因导入毛白杨，转基因植株
组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等抑菌效果明显。
（3）除草剂抗性基因工程 通过转抗除草剂基因，使林木产生对除草剂的抗性，提高除
Removal of volatile TCE by transgenic poplar
Genetically Engineered Poplar Plants Disarm Toxic Pollutants 100 Times Better Than Controls
ScienceDaily (Oct. 16, 2007)
RolB+GA20
对照
双价基因
转基因植株
对照
双价基因
(9) transgenic poplar capable of absorbing and breaking down various contaminants
overexpression of cytochrome P450 2E1
ScienceDaily (Jan. 15, 2008)
（CAD）、咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）等反义导入美洲 山杨、欧洲山杨、欧美杨杂种等杨树中，最高可使木质素 降低45%，而纤维素相应含量增加15%。
转反义4CL基因杨树植 株
转基因降低CAD
（7）生殖发育调控基因工程 David（1999）将DT-A基因转入杂种杨，检测获得的转基因
植株表现为雄性不育。 Weigel等（1995）获得了转拟南芥leafy基因杂种杨,花期明
2细胞突变体的产生
1)材料: 游离细胞 原生质体 小孢子 新鲜愈伤组织
2）体细胞变异类别 细胞内DNA重复复制 形成三极或多极纺锤体与产生非整倍体 染色体断裂和重组 类减数分裂现象
3）变异水平 染色体数目变异 染色体结构变异 基因突变等
4）突变体类型 抗病、除草剂、盐、抗生素等抗性突变体 雄性不育突变体 营养缺陷型突变体 产量、株型等性状突变体
以及提高野生种群中初始抗性基因频率实现的。 一种低成本的防治策略，可能会演变成一种高投入的生产必需过程甚至
生态危机。
▼转基因植株环境释放影响物种多样性 在适宜条件下，由花粉携带的外源基因经一定的空间漂移，容易与其
野生近缘种杂交，从而使非转基因植物相应性状的适合度增强或降低。 如Mikkelsen等（1996）研究了转耐除草剂BASTA基因油菜与杂草型亲
显提前。
转35S-LFY 促进山杨开花
Male flower on an early-flowering transgenic poplar line
transgene display reduced cytokinin content
RolB
GA20
The rooting of the transgenic tobaccos
（三）转基因植物的生态安全性问题
▼转基因林木大量种植加速树种遗传多样性丧失
转基因受遗传转化组培再生体系限制较大,甚至一个无性系就需要建立一套再 生体系，加之基因转化效率低，而获得基因高效表达植株的可能性更低，因此 很难实现多基因型的转化与筛选。
从林木品种遗传多样性角度看，有可能是一方面某种抗逆性状增强，而另一 方面却因遗传多样性的丧失带来更大的风险性，从而顾此失彼，得不偿失。
编码S-萜烯醇（S-linalool）合成酶，该酶可将牻牛儿焦磷酸（GPP）一步 转化成S-萜烯醇，因此这一基因对培养带有新型香味的转基因花卉具有潜 在价值。
如法国科研人员利用野生型发根农杆菌转化柠檬天竺葵，发现转化植株 中的芳香物质牻牛儿醇含量比对照株增加了3～4倍。
(12)延长切花寿命基因工程 对于乙烯跃变型的花卉，乙烯的生成是切花衰老的主要影响因子。ACC
3 分子标记技术
◆RFLP
Restriction fragment length polymorphisms
◆ RAPD ◆ AFLP ◆ SSR ◆ SNP
A composite linkage map for the conifer Picea glauca