(林木育种学)第八章林木生物技术
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第八章 生物技术与林木育种
一 林木细胞工程
（一）概念
细胞工程：是指以细胞为单位，在体外进行培养、繁殖或人为地使细胞 某些生物学特性按人们的意愿加以改变，从而达到改良或创造新品种，加速 繁育生物个体，或获得某种有用物质的过程。
细胞工程应用于育种时，主要利用染色体数目与结构变异以及基因突变 等遗传变异类型。包括细胞融合与细胞突变体的筛选等。
草效率，降低生产成本。 Harcourt等（2000）用农杆菌介导法转化赤桉获得了抗高剂
量广谱除草剂Liberty的转基因植株，其实验剂量（6L/hm2）是 田间实际用量的两倍。
（4）抗盐碱基因工程 刘凤华等（2000）利用土壤农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢
酶（mtl-D）基因导入八里庄杨，经测试可在含0.4%NaCl的基质上 正常生长。
显提前。
转35S-LFY 促进山杨开花
Male flower on an early-flowering transgenic poplar line
transgene display reduced cytokinin content
RolB
GA20
The rooting of the transgenic tobaccos
2细胞突变体的产生
1)材料: 游离细胞 原生质体 小孢子 新鲜愈伤组织
2）体细胞变异类别 细胞内DNA重复复制 形成三极或多极纺锤体与产生非整倍体 染色体断裂和重组 类减数分裂现象
3）变异水平 染色体数目变异 染色体结构变异 基因突变等
4）突变体类型 抗病、除草剂、盐、抗生素等抗性突变体 雄性不育突变体 营养缺陷型突变体 产量、株型等性状突变体
刘 斌 等 （ 2002 ） 利 用 根 癌 农 杆 菌 介 导 将 反 义 磷 脂 酶 Dγ 基 因 （PLDγ）转入三倍体毛白杨，获得可在含0.7%NaCl的培养基质上 生长的转基因植株等。
（5）耐低温基因工程
（6）木素合成相关基因工程 将 香 豆 酸 CoA 连 接 酶 （ 4CL ） 、 肉 桂 酰 乙 醇 脱 氢 酶
编码S-萜烯醇（S-linalool）合成酶，该酶可将牻牛儿焦磷酸（GPP）一步 转化成S-萜烯醇，因此这一基因对培养带有新型香味的转基因花卉具有潜 在价值。
如法国科研人员利用野生型发根农杆菌转化柠檬天竺葵，发现转化植株 中的芳香物质牻牛儿醇含量比对照株增加了3～4倍。
(12)延长切花寿命基因工程 对于乙烯跃变型的花卉，乙烯的生成是切花衰老的主要影响因子。ACC
3 分子标记技术
◆RFLP
Restriction fragment length polymorphisms
◆ RAPD ◆ AFLP ◆ SSR ◆ SNP
A composite linkage map for the conifer Picea glauca
Removal of volatile TCE by transgenic poplar
Genetically Engineered Poplar Plants Disarm Toxic Pollutants 100 Times Better Than Controls
ScienceDaily (Oct. 16, 2007)
RolB+GA20
对照
双价基因
转基因植株
对照
双价基因
(9) transgenic poplar capable of absorbing and breaking down various contaminants
overexpression of cytochrome P450 2E1
ScienceDaily (Jan. 15, 2008)
（二）基因工程的操作步骤与方法
1 目的基因的分离 ◆基因工程常用的工具酶
（1）限制性内切酶 （2）DNA连接酶 （3）DNA聚合酶 ◆目的基因分离与获得方法 （1）直接分离目的基因（鸟枪射击法） （2）酶促合成目的基因（逆转录法） （3）化学合成目的基因
2构建基因工程载体 载体：携带外源基因进入受体细胞的工具。 理想的质粒载体应具备的条件： ①在宿住细胞中能独立复制； ②DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，外源基因插入其中可以象 载体正常组分一样进行复制和扩增； ③基因组中有1～2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的特性； ④分子量小，可多次复制，易于操作。
（CAD）、咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）等反义导入美洲 山杨、欧洲山杨、欧美杨杂种等杨树中，最高可使木质素 降低45%，而纤维素相应含量增加15%。
转反义4CL基因杨树植 株
转基因降低CAD
（7）生殖发育调控基因工程 David（1999）将DT-A基因转入杂种杨，检测获得的转基因
植株表现为雄性不育。 Weigel等（1995）获得了转拟南芥leafy基因杂种杨,花期明
3目的基因转化 1）农杆菌介导基因转化法 2）PEG转化法 3）电穿孔法（电激法） 4）基因枪法 5）花粉管通道导入法
4转化细胞的筛选与转基因植株鉴定 1）通过检测标记基因或报告基因： 标记基因：nptⅡ基因（新霉素磷酸转移酶基因）、amp（氨苄青霉素
抗性基因）、hyg（潮霉素磷转移酶基因）等。 报告基因：gus基因（B-葡萄糖苷酶基因）、luc（绿色荧光蛋白基因）、
（二）细胞培养与融合
1 原生质体分离
①材料的选择
②材料的预处理 预培养法 暗处理法 药物及添加物处理法 萎蔫处理法 更新培养基法
③原生质体分离
④原生质体的收集与纯化
⑤原生质体活力鉴定
3 原生质体培养
1）原生质体培养方法 液体浅层静止法 固体培养法 饲养法
2）原生质体培养基 KM、KM8P、V-KM等
缘种B. campestris杂交、回交后代的育性，结果发现杂种花粉的育性超
过90%，且有42%左右的植株抗除草剂等。
三 分子标记辅助育种 1 DNA遗传标记的特点：
数量极多； 遗传上稳定； 排除了环境差异。
2 DNA遗传标记的应用
构建遗传图谱； 分析亲缘关系； 定位目的性状； 分子标记辅助选择； 种质资源及杂种后代的鉴定。
树，育成抗病无性系。 Nicolescu（1996）将矮牵牛黄酮合成酶（GHSA）基因导入杨树，
提高了抗病性。 赵世民等（1999）将兔NP-1防御素基因导入毛白杨，转基因植株
组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等抑菌效果明显。
（3）除草剂抗性基因工程 通过转抗除草剂基因，使林木产生对除草剂的抗性，提高除
对杨尺蠖、舞毒蛾的杀虫率达到90%以上。 李 明 亮 等 （ 2000 ） 采 用 农 杆 菌 介 导 法 将 蛋 白 酶 抑 制 剂 基 因
（PI） 导入含Bt基因的欧洲黑杨，双抗转基因植株抗虫能力明显 高于仅含Bt基因的植株。
转BT基因提高火炬松抗虫能力
（2）抗病基因工程 包括抗病毒病、抗真菌病和抗细菌病基因。 英国牛津大学病毒所克隆杨树花叶病毒PMV外壳蛋白基因并转化杨
(10)花卉花色基因工程 花卉的颜色主要由类黄酮、类胡萝卜素及花青素决定。利用外源花青
素结构基因和调节基因进行遗传转化，大多花卉上实现了花色改变。 如科研人员将玉米DFR（4-黄烷酮醇还原酶）基因导入矮牵牛，创造出
了矮牵牛淡砖红色新品种系列。
(11)花卉香味基因工程 主要集中于单萜（一类重要的花香物质）的合成过程研究。Lis基因可
2）间接选择法：是借助与突变表型有某种相关的特征 作为间接选择指标的选择方法。
如在离体培养细胞中直接选择抗旱性是较为困难的， 但可以通过选择抗脯氨酸类似物的突变细胞，从而间接筛 选出抗旱突变体。
二 基因工程
（一）概念
基因工程：就是按照人们预先设计的生物蓝图，应用人工方法将生物的 遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行分割、拼接和重组，进而将重 组DNA 导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性或获得某种基 因产物（多肽或蛋白），这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程， 或称为DNA重组技术。
以及提高野生种群中初始抗性基因频率实现的。 一种低成本的防治策略，可能会演变成一种高投入的生产必需过程甚至
生态危机。
▼转基因植株环境释放影响物种多样性 在适宜条件下，由花粉携带的外源基因经一定的空间漂移，容易与其
野生近缘种杂交，从而使非转基因植物相应性状的适合度增强或降低。 如Mikkelsen等（1996）研究了转耐除草剂BASTA基因油菜与杂草型亲
4 细胞融合的应用 近缘植物原生质体融合→偶数或奇数多倍体 远缘植物原生质体融合→双二倍体
wenku.baidu.com
（三）细胞突变体的筛选
1概念与优势 细胞突变体：是指在植物细胞培养过程中，因基因或染色 体结构发生改变而产生的细胞及其再生植株特征与特性的遗 传变异。 与常规方法相比，细胞突变体诱导与筛选具有诱变处理的 群体大，筛选方便的优点。
合成酶和ACC氧化酶是植物乙烯生物合成过程中的关键性酶，应用转基因 的方法抑制乙烯合成关键酶的活性可抑制乙烯的生成。
利用反义技术将ACC氧化酶或ACC合成酶基因的反义序列导入香石竹中， 转基因切花的寿命大大延长。
转基因改变表型—安全性研究
Decaffeinated coffee is now made by treating coffee beans to remove the caffeine.
nos（胭脂碱合成酶基因）等。
2）通过目的基因表达检测 ◆在转录水平上对特异mRNA进行检测
Northern杂交：包括斑点杂交及印迹杂交 ◆在翻译水平上对特异蛋白质进行检测
①生化反应检测法 ②免疫学检测法
免疫沉淀法 酶联免疫吸附法（ELISA） Western杂交 ③酶活性分析
基因枪法
（二）基因工程在林木育种中的应用 （1）抗虫基因工程 田颖川等（1993）将Bt基因转化欧洲黑杨，部分转基因植株
▼持续强选择压导致有害生物的协同进化 在实验室条件下，有甜菜夜蛾、烟芽夜蛾、粉斑螟、小菜蛾、欧洲玉米
螟、棉铃虫等多种昆虫经过6～19代筛选，抗性上升到70～500倍。 国内已有研究表明，棉铃虫对Bt农药与转Bt基因棉花品系间存在交互抗
性。 病虫抗性进化的实质就是环境压力对基因的选择，主要是通过基因突变
3突变细胞的筛选方法
1）直接选择法：是指新的突变表型在选择条件下能够优先生长，或预期从 感官上可以测定其它可见的差异。可分为正选择和负选择两种方式。
正选择：指在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的化合物，使正常细胞不 能生长而只有突变体才能生长，从而筛选出细胞突变体。
负选择：指用特定培养基使突变体细胞处于不能生长状态，而非突变细胞却 可以正常生长，然后用汰选剂淘汰正常生长细胞，最后使突变细胞恢复生长并 分离出来。
（三）转基因植物的生态安全性问题
▼转基因林木大量种植加速树种遗传多样性丧失
转基因受遗传转化组培再生体系限制较大,甚至一个无性系就需要建立一套再 生体系，加之基因转化效率低，而获得基因高效表达植株的可能性更低，因此 很难实现多基因型的转化与筛选。
从林木品种遗传多样性角度看，有可能是一方面某种抗逆性状增强，而另一 方面却因遗传多样性的丧失带来更大的风险性，从而顾此失彼，得不偿失。
一 林木细胞工程
（一）概念
细胞工程：是指以细胞为单位，在体外进行培养、繁殖或人为地使细胞 某些生物学特性按人们的意愿加以改变，从而达到改良或创造新品种，加速 繁育生物个体，或获得某种有用物质的过程。
细胞工程应用于育种时，主要利用染色体数目与结构变异以及基因突变 等遗传变异类型。包括细胞融合与细胞突变体的筛选等。
草效率，降低生产成本。 Harcourt等（2000）用农杆菌介导法转化赤桉获得了抗高剂
量广谱除草剂Liberty的转基因植株，其实验剂量（6L/hm2）是 田间实际用量的两倍。
（4）抗盐碱基因工程 刘凤华等（2000）利用土壤农杆菌介导法将1-磷酸甘露醇脱氢
酶（mtl-D）基因导入八里庄杨，经测试可在含0.4%NaCl的基质上 正常生长。
显提前。
转35S-LFY 促进山杨开花
Male flower on an early-flowering transgenic poplar line
transgene display reduced cytokinin content
RolB
GA20
The rooting of the transgenic tobaccos
2细胞突变体的产生
1)材料: 游离细胞 原生质体 小孢子 新鲜愈伤组织
2）体细胞变异类别 细胞内DNA重复复制 形成三极或多极纺锤体与产生非整倍体 染色体断裂和重组 类减数分裂现象
3）变异水平 染色体数目变异 染色体结构变异 基因突变等
4）突变体类型 抗病、除草剂、盐、抗生素等抗性突变体 雄性不育突变体 营养缺陷型突变体 产量、株型等性状突变体
刘 斌 等 （ 2002 ） 利 用 根 癌 农 杆 菌 介 导 将 反 义 磷 脂 酶 Dγ 基 因 （PLDγ）转入三倍体毛白杨，获得可在含0.7%NaCl的培养基质上 生长的转基因植株等。
（5）耐低温基因工程
（6）木素合成相关基因工程 将 香 豆 酸 CoA 连 接 酶 （ 4CL ） 、 肉 桂 酰 乙 醇 脱 氢 酶
编码S-萜烯醇（S-linalool）合成酶，该酶可将牻牛儿焦磷酸（GPP）一步 转化成S-萜烯醇，因此这一基因对培养带有新型香味的转基因花卉具有潜 在价值。
如法国科研人员利用野生型发根农杆菌转化柠檬天竺葵，发现转化植株 中的芳香物质牻牛儿醇含量比对照株增加了3～4倍。
(12)延长切花寿命基因工程 对于乙烯跃变型的花卉，乙烯的生成是切花衰老的主要影响因子。ACC
3 分子标记技术
◆RFLP
Restriction fragment length polymorphisms
◆ RAPD ◆ AFLP ◆ SSR ◆ SNP
A composite linkage map for the conifer Picea glauca
Removal of volatile TCE by transgenic poplar
Genetically Engineered Poplar Plants Disarm Toxic Pollutants 100 Times Better Than Controls
ScienceDaily (Oct. 16, 2007)
RolB+GA20
对照
双价基因
转基因植株
对照
双价基因
(9) transgenic poplar capable of absorbing and breaking down various contaminants
overexpression of cytochrome P450 2E1
ScienceDaily (Jan. 15, 2008)
（二）基因工程的操作步骤与方法
1 目的基因的分离 ◆基因工程常用的工具酶
（1）限制性内切酶 （2）DNA连接酶 （3）DNA聚合酶 ◆目的基因分离与获得方法 （1）直接分离目的基因（鸟枪射击法） （2）酶促合成目的基因（逆转录法） （3）化学合成目的基因
2构建基因工程载体 载体：携带外源基因进入受体细胞的工具。 理想的质粒载体应具备的条件： ①在宿住细胞中能独立复制； ②DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，外源基因插入其中可以象 载体正常组分一样进行复制和扩增； ③基因组中有1～2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的特性； ④分子量小，可多次复制，易于操作。
（CAD）、咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）等反义导入美洲 山杨、欧洲山杨、欧美杨杂种等杨树中，最高可使木质素 降低45%，而纤维素相应含量增加15%。
转反义4CL基因杨树植 株
转基因降低CAD
（7）生殖发育调控基因工程 David（1999）将DT-A基因转入杂种杨，检测获得的转基因
植株表现为雄性不育。 Weigel等（1995）获得了转拟南芥leafy基因杂种杨,花期明
3目的基因转化 1）农杆菌介导基因转化法 2）PEG转化法 3）电穿孔法（电激法） 4）基因枪法 5）花粉管通道导入法
4转化细胞的筛选与转基因植株鉴定 1）通过检测标记基因或报告基因： 标记基因：nptⅡ基因（新霉素磷酸转移酶基因）、amp（氨苄青霉素
抗性基因）、hyg（潮霉素磷转移酶基因）等。 报告基因：gus基因（B-葡萄糖苷酶基因）、luc（绿色荧光蛋白基因）、
（二）细胞培养与融合
1 原生质体分离
①材料的选择
②材料的预处理 预培养法 暗处理法 药物及添加物处理法 萎蔫处理法 更新培养基法
③原生质体分离
④原生质体的收集与纯化
⑤原生质体活力鉴定
3 原生质体培养
1）原生质体培养方法 液体浅层静止法 固体培养法 饲养法
2）原生质体培养基 KM、KM8P、V-KM等
缘种B. campestris杂交、回交后代的育性，结果发现杂种花粉的育性超
过90%，且有42%左右的植株抗除草剂等。
三 分子标记辅助育种 1 DNA遗传标记的特点：
数量极多； 遗传上稳定； 排除了环境差异。
2 DNA遗传标记的应用
构建遗传图谱； 分析亲缘关系； 定位目的性状； 分子标记辅助选择； 种质资源及杂种后代的鉴定。
树，育成抗病无性系。 Nicolescu（1996）将矮牵牛黄酮合成酶（GHSA）基因导入杨树，
提高了抗病性。 赵世民等（1999）将兔NP-1防御素基因导入毛白杨，转基因植株
组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等抑菌效果明显。
（3）除草剂抗性基因工程 通过转抗除草剂基因，使林木产生对除草剂的抗性，提高除
对杨尺蠖、舞毒蛾的杀虫率达到90%以上。 李 明 亮 等 （ 2000 ） 采 用 农 杆 菌 介 导 法 将 蛋 白 酶 抑 制 剂 基 因
（PI） 导入含Bt基因的欧洲黑杨，双抗转基因植株抗虫能力明显 高于仅含Bt基因的植株。
转BT基因提高火炬松抗虫能力
（2）抗病基因工程 包括抗病毒病、抗真菌病和抗细菌病基因。 英国牛津大学病毒所克隆杨树花叶病毒PMV外壳蛋白基因并转化杨
(10)花卉花色基因工程 花卉的颜色主要由类黄酮、类胡萝卜素及花青素决定。利用外源花青
素结构基因和调节基因进行遗传转化，大多花卉上实现了花色改变。 如科研人员将玉米DFR（4-黄烷酮醇还原酶）基因导入矮牵牛，创造出
了矮牵牛淡砖红色新品种系列。
(11)花卉香味基因工程 主要集中于单萜（一类重要的花香物质）的合成过程研究。Lis基因可
2）间接选择法：是借助与突变表型有某种相关的特征 作为间接选择指标的选择方法。
如在离体培养细胞中直接选择抗旱性是较为困难的， 但可以通过选择抗脯氨酸类似物的突变细胞，从而间接筛 选出抗旱突变体。
二 基因工程
（一）概念
基因工程：就是按照人们预先设计的生物蓝图，应用人工方法将生物的 遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行分割、拼接和重组，进而将重 组DNA 导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性或获得某种基 因产物（多肽或蛋白），这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程， 或称为DNA重组技术。
以及提高野生种群中初始抗性基因频率实现的。 一种低成本的防治策略，可能会演变成一种高投入的生产必需过程甚至
生态危机。
▼转基因植株环境释放影响物种多样性 在适宜条件下，由花粉携带的外源基因经一定的空间漂移，容易与其
野生近缘种杂交，从而使非转基因植物相应性状的适合度增强或降低。 如Mikkelsen等（1996）研究了转耐除草剂BASTA基因油菜与杂草型亲
4 细胞融合的应用 近缘植物原生质体融合→偶数或奇数多倍体 远缘植物原生质体融合→双二倍体
wenku.baidu.com
（三）细胞突变体的筛选
1概念与优势 细胞突变体：是指在植物细胞培养过程中，因基因或染色 体结构发生改变而产生的细胞及其再生植株特征与特性的遗 传变异。 与常规方法相比，细胞突变体诱导与筛选具有诱变处理的 群体大，筛选方便的优点。
合成酶和ACC氧化酶是植物乙烯生物合成过程中的关键性酶，应用转基因 的方法抑制乙烯合成关键酶的活性可抑制乙烯的生成。
利用反义技术将ACC氧化酶或ACC合成酶基因的反义序列导入香石竹中， 转基因切花的寿命大大延长。
转基因改变表型—安全性研究
Decaffeinated coffee is now made by treating coffee beans to remove the caffeine.
nos（胭脂碱合成酶基因）等。
2）通过目的基因表达检测 ◆在转录水平上对特异mRNA进行检测
Northern杂交：包括斑点杂交及印迹杂交 ◆在翻译水平上对特异蛋白质进行检测
①生化反应检测法 ②免疫学检测法
免疫沉淀法 酶联免疫吸附法（ELISA） Western杂交 ③酶活性分析
基因枪法
（二）基因工程在林木育种中的应用 （1）抗虫基因工程 田颖川等（1993）将Bt基因转化欧洲黑杨，部分转基因植株
▼持续强选择压导致有害生物的协同进化 在实验室条件下，有甜菜夜蛾、烟芽夜蛾、粉斑螟、小菜蛾、欧洲玉米
螟、棉铃虫等多种昆虫经过6～19代筛选，抗性上升到70～500倍。 国内已有研究表明，棉铃虫对Bt农药与转Bt基因棉花品系间存在交互抗
性。 病虫抗性进化的实质就是环境压力对基因的选择，主要是通过基因突变
3突变细胞的筛选方法
1）直接选择法：是指新的突变表型在选择条件下能够优先生长，或预期从 感官上可以测定其它可见的差异。可分为正选择和负选择两种方式。
正选择：指在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的化合物，使正常细胞不 能生长而只有突变体才能生长，从而筛选出细胞突变体。
负选择：指用特定培养基使突变体细胞处于不能生长状态，而非突变细胞却 可以正常生长，然后用汰选剂淘汰正常生长细胞，最后使突变细胞恢复生长并 分离出来。
（三）转基因植物的生态安全性问题
▼转基因林木大量种植加速树种遗传多样性丧失
转基因受遗传转化组培再生体系限制较大,甚至一个无性系就需要建立一套再 生体系，加之基因转化效率低，而获得基因高效表达植株的可能性更低，因此 很难实现多基因型的转化与筛选。
从林木品种遗传多样性角度看，有可能是一方面某种抗逆性状增强，而另一 方面却因遗传多样性的丧失带来更大的风险性，从而顾此失彼，得不偿失。