枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶优化试验研究

稀释倍数; 4为反应试剂总体积, m ;l 10为反应时间, m in。 1. 3. 3 氨基态氮测定
用甲醛滴定法测定, 计 算公式如下:
氨基态氮 =
(V1-
V2 ) @ C @ 0.
M
@
20 1 00
01 4 @ 100% ,
式中, V 1 为稀释液在加入甲醛后滴定至 pH 9. 2所用 N aOH 标 准溶 液 的 体 积, m ;l V2 为 空 白 滴 定 在 加 入 甲 醛 后 滴 定 至 pH9. 2所用 N aOH 标准溶液 的体积, m ;l C 为 N aOH 标准溶 液 的浓度, m ol/L; M 为称取的豆粕 或发酵 豆粕的 质量, g; 0. 014
样量: 10 L 。l 1. 3. 7 十 二 烷 基 磺酸 钠 - 聚 丙 烯 酰胺 凝 胶 电 冰 ( SD S -
PAGE ) [ 9] ( 1)大豆蛋白的提取 (根据文 献 [ 10]方法, 略有 改动 ) 取已冻干、过 80目的豆粕粉和发酵 72 h的发酵豆粕, 用 乙醚 (豆粉与 乙醚 的 体积 比 为 1B6 ) 脱脂 3 次, 脱 脂豆 粉 用 10倍体积的蒸馏水分 散 (搅 拌 ) 完全, 之后 用 2 mo l/L N aOH 调 节 至 pH 8. 0, 室 温 下 搅 拌 2 h 后 离 心 ( 9 000 r /m in, 30 m in)。离心所得的上清液经 2 m o l/L H C l调节至 pH 4. 6, 于 4e 下 放置 2 h, 之后离 心。所得 沉淀物用 蒸馏水 洗 3次, 用蒸馏水重新分散, 并调节至中性。该分散液经透析 24 h后 冷冻干燥, 即得大豆分 离蛋白。 ( 2)样品处理 (蛋白质标准品 按说明书处理 ) 在不连续缓冲系统上, 分离胶和浓缩胶 质量分数分 别为 7. 2% 和 4% 。准确称取 ( 4. 0 ? 0. 1) m g样品 和移取 1. 00 m l 样品缓 冲液 ( 3. 2 m l pH6. 8、50 mm o l/L T ris- HC l、11. 5 m l 10% SD S溶液、2. 5 m l B-巯基 乙醇、溴酚 蓝 2 m g 以 及甘 油 5 m ,l 定容至 50 m l)于 1. 50 m 离l 心管 中充分混匀, 100e 水浴 5 m in, 取 出 冷 却 后 于 SDS - PAGE 样 品 槽 中 均 匀 注 入 16. 00 L 的l 样品液。 ( 3)电泳条件 采取恒 流。电 流 先 取 10 mA, 待 进 入 分 离 胶 后 改 为 25 mA, 电泳 2. 5 h。电泳 结束后, 剥 胶、染 色、脱色 及拍照 保 存。染色采用考马斯亮蓝 R - 250。
1 材料与方法 1. 1 试验材料 1. 1. 1 试剂
福林试剂 (钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、液溴 )、碳酸钠、三氯 乙酸 ( TCA )、甲醛、氢氧 化钠、乙 醇等, 均 为分 析纯; 干 酪素、 酪氨酸、低分 子质量 ( 24~ 97 ku) 标准蛋 白和其 它电泳试 剂 均为生化试剂 (北京某生物技术有限责 任公司 )。 1. 1. 2 原料
低温豆粕。 1. 1. 3 菌株及培养基
菌株: 本实验室筛 选并保 藏枯草 芽孢杆 菌 ( Bacillus Subtilis ); 斜面培养基: 牛肉膏 3 g /L, 蛋 白胨 10 g /L, N aC l 5 g /L, 琼脂 2 g /L, pH 7. 0; 种 子 培 养 基: 牛 肉 膏 3 g /L, 蛋 白 胨 10 g /L, N aC l 5 g /L, pH 7. 0。 1. 1. 4 设备
32 饲料资源开发与利用
2009, No. 2
枯草芽孢杆菌发酵豆粕产蛋白酶优化试验研究
卓林霞, 吴 晖, 刘冬梅
(华南理工大学轻工与食品学院, 广东 广州 510640)
摘 要: 在单因素试验的基 础上, 以蛋白酶活力为指 标, 研 究枯草 芽孢杆 菌固态 发酵豆 粕产蛋 白酶的最 优条件。 采用响 应面 分析法对培养基中初始 pH 值、接种量和料水比进行三因素三 水平分析 , 得 出最佳 水平为 pH 6. 6, 接种 量为 3. 8% , 料水 比为 1B1, 此条件下发酵豆粕中蛋白酶活力可达 648 U /g; 较发酵前提高了 2. 55倍。 关键词: 固态发酵; 枯草芽孢杆菌; 发酵豆粕; 蛋白酶; 响应面法 中图分类号: S816. 6 文献标识码: A 文章编号: 1003- 6202( 2009) 02- 0032- 04 O ptim ization for Solid- sta te Ferm en tation P rodu cin g P rotease of Soybean M eal ferm en ted by B ac illus Subtilis
为氮的毫摩尔质量, g /mm ol。 1. 3. 4 水解度的测定 [ 8]
甲醛滴定法测定氨基态氮含量, 氮含量采 用微量凯 氏定
氮法, 水解度 ( DH )计算公式如下 :
- NH2 的含量 - 0. 33
DH =
6. 25 @N 7. 8
@ 100% ,
( 3)
式中, / - NH2 含量 0为 氨基 态氮的 含量, Lmo l/m ;l N 为样 品 中氮的含 量, g /m ;l 6. 25 为氮 的转 化系数; 0. 33为 豆粕中 游
温度, 培养时间、接种量和初始 pH 值对枯草芽孢杆 菌生长产 蛋白酶的影响后, 以蛋白酶 活力值 ( U /m l)为 响应面 值, 通 过
SA S试验确定豆粕固态发酵的最优条件。 1. 3 豆粕及发酵豆粕各成分的测定
1. 3. 1 粗蛋白质含量的测定 参照 GB /T 5009. 5) 2003。
ABSTRACT: T he optim a l cond itions for so lid- sta te ferm entation producing pro tease of soybean m ea l ferm ented by Bacillus Subtilis we re stud ied on the bas is o f sing le factor test and tak ing the activ ity of pro tease as an index. A cco rd ing to response surface m ethod, the change o f the in itia l pH, ino cu lation am ount and ratio o fm ater ia l to w ate r we re ana ly zed, the optimum conditions w ere obta ined as fo-l low s: pH 6. 6, inocu la tion am ount 3. 8% and m ate ria-l w ater ratio 1B1. U nder these cond itions, the pro tease activ ity cou ld reach 648 U /g, wh ich w as inc reased by 2. 55 tim es in comparison w ith tha t be fo re the ferm en tation. KEYW ORDS: so lid- sta te ferm entation; Bacillus subtilis; fe rmented soybean m ea;l protease, response surface me thod
收稿日期: 2008- 09 - 15; 修回日期: 2009 - 01 - 16 基金项目: 粤港关键领域重点突破项目 ( 2007A 020903002) 作者简介: 卓林霞 ( 1982 - ), 在读硕士研究生, 研究方向为食品微生物及食品质量安全。 通讯作者: 刘冬梅 ( 1971 - ), 讲师, 研究方向为工业微生物及食品质量安全。
豆粕是大豆提取豆油后的副产品, 其中蛋 白质质量 分数 高达 43% 以上。由于豆粕中缺乏水产动物必需的氨基酸, 并 含有胰蛋白酶抑制因子、植 物血凝素和抗维生 素等抗营 养因 子 [ 1] , 限制了其应用。发酵豆粕是豆粕经过微 生物发酵 后的 高蛋白饲料产品, 微生物产 生的各类消化酶类 可有效地 降解 其中的抗营养因子和大分子营养物质 [2] , 使豆 粕更容易 消化 和吸收。枯草芽孢杆菌在适宜的条件下可产 生多种酶 类 [ 3], 使豆粕适口性更佳 [ 4] 。
菌种活化 y 种子培养基 y 接种
| 豆粕 y 预处理 y 121e 灭菌 20 m iny 培养基 y 固态 发酵 y 冷冻干燥 y 粉碎 y 加水浸提 y 离心 y 上清液 1. 2. 2 菌种活化及种子扩大培养 配制营 养 肉 汤 种 子 培 养 基, 将 50 m l营 养 肉 汤 装 于 250 m l三角瓶中, 包扎封 口后, 于 121e 、0. 1 M P a条件下灭菌 20 m in; 冷却后接入斜面 培养 24 h 的枯草 芽孢 杆菌一 环, 在 转速 200 r/m in、温度 ( 30 ? 1) e 条件下摇瓶培养 20 h。 1. 2. 3 豆粕固态发酵培养 500 m l三角瓶中加入豆粕 50. 00 g、水 50 m ,l 在 pH 7. 0、 121e 条件下灭菌 20 m in, 冷却至 室温接 入 20 h 种龄的 适量 种子液, 于不同发酵条件下培养 发酵。发酵 结束后将发 酵产 物冷冻干燥, 研碎过筛 , 备用。 1. 2. 4 发酵水提液的制备 称取 过 80 目 的发 酵 豆粕 5. 000 g, 加入 蒸馏 水 定容 至
响应面法是数学方法和统计方法 结合的工程 优化方法, 主要用于对生物产量 受多个 因素 影响的 问题 进行 建模和 分 析, 其最终目的是 优化该 响应 值, 从而快 速有 效地 确定最 佳 条件。近年来, 响应面法在化工、生物、食品等领域也 都得到 了广泛应用。本研究的目的是以枯草芽 孢杆菌为 发酵剂, 以 枯草芽孢杆菌产蛋白酶活力为指标, 应用响应 面法对豆 粕进 行固态发酵优化试验 的研 究, 以获得 最优 化的 条件, 进而 提 供更营养的发酵豆粕。
离的氨态氮含量, Lm ol/g; 7. 8为 豆粕完全水解后氨基态氮含 量, Lmo l/g。
1. 3. 5 菌落计数法 取 1. 000 g发酵 豆粕 接种于 10 m l的无 菌生 理盐 水中,
并吸取 1. 00 m l依次按梯度稀释进行平板计数, 重复 3次。 1. 3. 6 氨基酸分析
取 1. 2. 3各样 品的上 清液 进行测 定豆 粕与 发酵 豆粕 中 游离氨基酸 ( FAA )含 量。分析 柱为 P ICO. TAG 氨基 酸分 析 柱; 温度为 38e ; 检测波长为 254 nm; 流速为 1. 00 m l/m in; 进
卓林霞等: 枯草芽孢杆菌发 酵豆粕产蛋白酶优化试验研究 /2009年第 2期
33
100 m ,l 在 40e 、100 r /m in下水浴浸提 1 h, 4 000 r /m in 离心 20 m in, 取上清液待测。
Байду номын сангаас
1. 2. 5 响应面法分析 通过感官分析、蛋白 酶活力 研究 对豆粕 的料 水比、发 酵
示为每 1 g发酵豆粕中的蛋白酶活力 (以下表述同 )。 具体 操 作 步 骤 及 标 准 曲 线 参 考 文 献 [ 7 ]。 计 算 公 式
如下:
蛋白酶活力 =
$A 660
@ K @N 10
@4 ,
( 1)
式中, $A 660为样品测定与空白试验光密 度之差; K 为 A 660为 1 时在标准曲线上对应的酪氨酸浓度, 取 K = 95; N 为粗酶液的
1. 3. 2 蛋白酶活力的测定 用福林法测定 [ 5] 。本试验酶活力定 义为在 40e 、pH 7. 2
条件下, 1 m l发酵水 提 液 ( 粗酶 液 ) 、1 m in 水解 酪蛋 白产 生
1 L g酪氨酸为 1 个 蛋 白 酶 活 力 单位 ( U ), 单 位 为 / U /m l0。 / U /m l0转换成 / U / g0单位时需除以样品干物质的含量 [ 6], 表
DYY - 6C 型电 泳仪 及 电泳 槽, 可 见分 光 光 度计 22PC, HH 型电热恒温 水浴 锅, PQX 型 多段 可控 人工 气 候箱, 超 净 工作台, 真空 冷 冻干 燥机, 高效 液相 色 谱仪, 自 动 凯氏 定 氮 仪, 高压灭菌锅, 恒温摇床机, 磁 力搅拌器等。 1. 2 试验方法 1. 2. 1 试验流程