细胞化学与组织化学

要视研究目的，观察部位而定。取材时应考虑： 主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常 组织。
4.取材时间 原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、肺、
肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后30min 内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织 取材要求心脏还在跳动时取材，脑组织和神经组织应采 用灌注预固定后，再进行后固定。 5.注意包埋方向，包埋时要平整。 6.保持材料的清洁 7.切除不需要的部分，骨组织需脱钙 8.明确编号，登记
激光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个细 胞进行细胞“CT”分析，并能研究活细胞和定量 分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的 酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和离 子的浓度及其分布，如Ca2+和pH值等)，
二、组织化学技术的基本要求
1．尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化 学成分和酶的活性。必须选择适当的固定液和 恰当的处理方法。
例如吖啶橙可以同时对细胞内的DNA和RNA染色，细 胞核的DNA呈亮绿色-黄绿色荧光，胞质和核仁的RNA呈桔 红色荧光。
组织与细胞材料的制备
一、组织取材注意事项
1.注意防止人为因素的影响 刀和剪要快，刀要足够长。
2.组织块的大小 大小可根据需要而定，一般长1cm×宽1cm×厚
0.2～0.3cm。 3.动物和人体组织的取材位置
最常用的底物标记法为放射自显影术，即70年代后 兴起的同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物， 在酶的作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在组织 结构上，通过放射自显影过程对沉着于酶所在部位的底 物进行捕捉。
七）荧光染色与免疫荧光法原理
荧光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞中 的化学成分直接染色，在荧光显微镜下对这些成分 进行直接观察。
一、组织化学发展简史
组织化学是在组织学和化学的基础上发展起来 的，早在十九世纪，人们把显微镜与化学技术结合 起来，开始观察组织中的化学反应，解释生物界中 的生理现象。
(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞 学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组 织学的概念转为显微化学。
依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反 应形成酶细胞化学。
二）偶氮偶联法原理
用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解
产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，而 形成不溶性的偶氮色素。
碱性磷酸酶＋水
α萘基磷酸钠
磷酸氢二钠＋α萘酚
α萘酚＋FAST BLUE
偶氮染料↓
三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理
利用细胞中多糖放出的醛基可将Schiff氏剂中的无色品 红转变为紫红色化合物，可于显微镜下观察到。
组织化学技术
序言
现代组织化学是介于细胞生物学、组织学、 生物化学及分子生物学之间的一门新兴边缘学科， 它已渗透和应用于生命科学的许多领域。近几十 年来，组织化学发展突飞猛进，日新月异，已产 生了许多分支，各类分支虽有特点，但都源于组 织化学。因此，组织化学已成为医学生物学科研 过程中必备知识之一。
(5) Methacarn固定液：甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml， 混均后4℃保存备用，对核内抗原的保存效果较好。
(6) 丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原 理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是一 种还原剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固 定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。 甲醇、丙酮常用于细胞固定。
三、组织标本的固定
1.目的 (1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和
腐败，以保持组织细胞的固有形态 (2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各
种抗原成份转变成不溶性物质，以保持 它原有的结构与生活时相仿
（3）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有 形态结构，固定剂兼有硬化作用
（4）经过固定的组织能对染料产生不同的亲 和力而着色清晰，便于辨认。
四、细胞化学染色的原理：
细胞中的化学成分和其相应的底物呈一 系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的 反应产物。常用组织化学方法的原理如下：
一）金属-金属盐沉淀反应原理
利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化 合物在与细胞化学成份反应过程中生成有色 沉淀，借以辨认所检查的物质。
如磷酸酶分解磷酸底物后，可与铅/钴形成磷酸铅，在 硫存在时形成 PbS或CoS的棕黑色沉淀，从而标出酶所在部 位。
2．化学反应要求在细胞或组织内进行，须有定位 的准确性。为此必须控制反应的时间和条件， 使反应的产物不移位，不弥散。
3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的 沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能 保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具 有一定的比例关系。
4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。 5Βιβλιοθήκη Baidu反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。 6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。
三、细胞化学技术显示的化学成分：
蛋白质：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基； RNA和DNA； 糖类：如糖原、粘多糖和糖脂等； 脂类：如中性脂肪、磷脂和胆固醇等； 酶： 包括水解酶(如磷酸酶、酯酶、肽酶)、氧化酶(琥珀
酸脱氢酶、过氧化酶、细胞色素氧化酶)和激酶、转移酶 等； 生物胺：5-羟色胺、肾上腺素类、组织胺等； 特异抗原：其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等； 无机盐和微量元素：如铁、铜、锌、钴、镁等。
固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种类 及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固定 时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间 成反比。
组织固定后必须彻底冲洗。
(2) 4％多聚甲醛固定液
(3) Bouin’s液
苦味酸饱和水溶液 75ml
甲醛
25ml
冰醋酸
5ml
渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构 完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺 特殊染色效果好。固定为12～24小时，但固定过久， 对碱性染料着色不利。
（4）Carnoy氏液 纯酒精 氯仿 冰醋酸
这种反应多用于显示细胞中的糖类和细胞核内的DNA， 前者称为PAS反应，后者称为Feulgen反应。此外，还可用 于检查细跑中的粘蛋白和不饱和脂类。
四）联苯胺法原理
过氧化氢酶分解H2O2产生新生氧，后者 可将无色联苯胺氧化，生成联苯胺蓝，进而 变成棕黑色化合物。此法主要显示细胞中的 过氧化物酶。
五）色素形成法原理
二、细胞材料的准备
培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有： （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在包被有切 片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，固定后备用。
胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离 心沉淀法收集细胞。
60ml 30ml 10ml
此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时 间2～4小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞 分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精 脱水。
(4) PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固 定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗 原的抗原性保存较好。
组织化学（histochemistry）/细胞化学(cytochemistry) 是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对 组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定 位和定量研究的科学。
主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖和 脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚细胞 组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。
是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在 酶的作用下，使无色的化学物质在细胞局部形成 色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。
色素形成法主要包括四唑盐法（NBT、 MTT）、靛蓝形成法等。其中四唑盐法用于定性 各种氧化还原酶、多种脱氢酶、转移酶。靛蓝反 应用于酯酶、磷酸酶等
六）底物标记法原理
底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底 物，在酶的作用下，底物分解后沉着于酶所在的部位。
70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微 光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形 成了定量细胞化学。
80年代电镜细胞化学可以观察化学成 分的亚细胞定位。
80 ～ 90年代，先后流式细胞术、激光 扫描共聚焦显微技术出现。
流式细胞术是一种快速对单细胞化学成分定 量分析的新技术，每秒可测上万细胞信息，从一 个细胞中，可同时测量多种参数。
2.固定液的种类
固定液分为单纯固定液和混合固定液两种。 （1）甲醛固定液：
是一种还原剂，呈酸性，原液浓度为37%～40%，配成固定液的 浓度为4%甲醛。配制时取甲醛原液10ml，加双蒸水或缓冲液至 100ml，为甲醛固定液（习惯上称为10％福尔马林） 。
甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法 中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁，pH为7.6，可长期保 持中性。甲醛固定后，通常需用流水冲洗12 ～ 24小时,否则影响 染色效果。