变性梯度凝胶电泳系统介绍

变性梯度凝胶电泳系统介绍

变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis, DGGE）分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA 链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。这个方法是应用最早也是最常用的突变筛查方法之一，在过去的十年中经历了很大的改进。

1.原理

如果DNA 双链分子全长不断增加温度或用化学变性剂处理，两条链就会开始分开（解链）。首先解链的区域由解链温度较低的碱基组成。GC碱基对比AT碱基对结合得要牢固，因此G.C含量高的区域具有较高的解链温度。同时影响解链温度的因素还有相邻碱基间的吸引力（称作“堆积”）。解链温度低的区域，通常位于端部称作低温解链区（lower melting domain）。如果端部分开，那么双螺旋就由未解链部分束在一起，这一区域便称作高温解链（high melting domain）(图1) 。

图1

如果温度或变性剂浓度继续升高，两条链就会完全分开。变性梯度凝胶电泳法依据首要的一点是：DNA双链末端一旦解链，其在凝胶中的电泳速度将会极剧下降。

图2

第二个根据是，如果某一区域首先解链，而与其仅有一个碱基

之差的另一条链就会有不同的解链温度，因此，将样品加入含有变性

剂梯度的凝胶进行电泳就可将二者分开（图2, 1 和2 道）。最终，

如果一双链在其低温解链区碱基错配（异源双链），而与另一等同的

双链相比差别仅在于此，那么，含有错配碱基的双链将在低得多的变

性剂浓度下解链。事实上，样品通常含有突变、正常的同源双链以及

配对的异源双链，后者是在PCR扩增加时产行的。而含有错配的双

链（图2中的3和4道）通常可以远远地与两个同源双链（图2中1

和2道）分开，这种分离效果使该方法灵敏度很高。为使仅有一个碱

基之差的不同分子取得最好的分离效果，必须先选择所要研究的DNA范围以及电泳样品时变性剂浓度梯度。这可以按图2 所示的正交变性梯度实验进行经验性地解决。变性剂梯度应选在曲线斜率大的部分，因为这时多数分子处于部分变性状态这使得落入低温解链区的不同分子达到最佳分离。

现在多数分析是用“GC夹板”（clamp）技术进行的。它是将一段长度为30-50碱基，富含GC的DNA 附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区。这样，片段的其他部分就处在低温解链区从而可以对其进分析。这一技术使该方法可检测的突变比例大大增加，其中许多操作今天已普遍使用。本表仅列出该方法的主要的发展经过，包括使用异源双链“GC 夹板”技术，PCR及专门的计算机程序等。PCR 反应技术的问世使非标记技术简便了许多。

2.DGGE 法的优缺点

优点:

1.DGGE的凝胶具有变性剂浓度梯度，可以根据DNA片段的退火温度分辨不同片段，分辨率可以达到一个碱基

2.DGGE有精密控温系统，比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更高的可重复性

3.DGGE可以对环境样品DNA的PCR产物进行分离进而克隆测序，比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳仅仅根据片段长短进行分离前进了一大步。

4.几乎可以检出所有突变

5.可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析

6.无须对引物标记

7.可检测出象甲基化之类的DNA修饰

缺点:

1.需要专门的电泳设备

2.需要在上游引物前端合成“GC夹板”

3.DGGE的应用

环境样品细菌、古细菌、真菌、真核微生物等生物的多样性分析（土壤、水等样品，无需培养，直接提取DNA扩增检测）；动、植物体内外共生微生物的检测；食品微生物的检测；医学领域碱基突变的检测，杂合子检测等等。

变性梯度凝胶电泳系统使用说明

一、系统仪器组成：

电泳控温槽一台、电泳支架两套（包括玻璃板三副、梳子两副、夹子16个）、程控电泳仪一台、梯度混合仪（含转子、电源）一套、缓冲液虹吸泵一副。

规格及参数：

１．电泳控温槽：

高温钢化玻璃控温槽：（长）51cm×（宽）28cm×（高）24cm，总容积34 L（推荐电泳缓冲液最佳体积21L）。全封闭设计，水蒸汽凝结后会重新回到槽中，不必补充缓冲液并防止蒸汽扩散到实验室内。

温度数字显示，加热器工作、保温状态显示。加热器功率1500W，控温精度：±0.1℃，控温范围：室温至70℃，自动过热保护。

可调速循环匀温水泵，出水口方向及出水量大小可调。

开盖自动断电保护装置，开盖后所有电源完全断开，确保安全。开盖后须重新启动电源。仪器可连续24小时工作。

２．电泳支架及附件

玻璃板：（长）22cm×（宽）17.7cm 。一块带有有凹槽，另一块粘有和梳子同样厚度有边条和密封边条，使用时将两块玻璃对齐合起，在电泳支架底部放好橡胶条，按图安装在支架上，旋紧压紧螺丝，使玻璃内部形成一个三面密封的槽，灌入去离子水检查是否有渗漏，不漏可放好待用。

梳子标准配置为1mm 厚21齿，如需其它规格可定制。

3．电泳仪

：功率300 W，恒流范围0- 150mA，恒压范围0- 200V ，微脑控制可编程分段定时定压。开机后按“转换”键，组合“设时”“设分”键，可选择第一时段或第二时段的电泳时间，调节旋扭可调电泳电压，设定完成后按启动键，秒脉冲显示灯闪动，表示即开始工作。

时间显示为倒计数式，两时段都减为0后，仪器自动关闭。

二、实验流程

DNA样品的提取→ PCR扩增→ DGGE电泳→ 带型分析→ 特征条带的测序。

三、DGGE过程

1 试剂的配制和梯度变性胶的配方

1.1 40%的凝胶单体（丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺：37.5/1）：称取38.93g丙烯酰胺和1.07g甲叉双丙烯酰胺，加入去离子水定容至100ml 后用0.45μm的滤膜过滤后装入棕色瓶4°C保存。

1.2 100%变性剂：取42ml去离子甲酰胺、42g尿素，用去离子水定容至100 ml后用0.45μm的滤膜过滤后装入棕色瓶4°C保存。

1.3 50×TAE缓冲液（Tris 2mol/L，冰醋酸1mol/L，EDTA 50mmol/L，pH8.0）

1.4 10%过硫酸铵溶液（W/V，为保证良好的引发效果，建议现配现用）

1.5 TEMED（分析纯）

梯度变性胶的配方（浓度为8%的变性胶）