酶的分离纯化

2 建立一个可靠和快速的测活方法 方法专一、灵敏、精确、简便、经济 3. 酶原料的选择 选择目的酶含量丰富的原料，且考虑原料 的来源、取材方便、经济等因素。 4. 酶的提取
5. 酶的提纯


产率=(目的酶的总活力/粗抽提液中目的酶总活 力)*100% 反映提纯过程酶活力的损失情况
提纯倍数=目的酶的比活力/粗抽提液中目的酶比 活力 提纯方法的效率
选择性热变性 选择性酸碱变性 选择性表面变性
5）特殊基团差异: 亲和层析
有的方法是建立在上述二个功能同时起作用。
第三节
方法 盐析 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀
沉淀分离
改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出
原理 不同蛋白质在不同盐浓度溶液中溶解度不同 两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性 电解质有不同的等电点 酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀 下来
葡聚糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
五、离子交换层析

重要而广泛应用的层析方法。离子交换剂为固定 相，液体为流动相的系统 基本原理：
离子交换剂在水中呈不溶解状态，能释放出反离子，同时 与溶液中的其它离子或离子化合物相互结合，结合后本身 理化性质保持不变

1.基本原理

纤维素－O－CH2－COO- ---Na+
1. 动、植物材料
绞肉机切碎，高速组织捣碎机，加砂研磨
2. 微生物材料
霉菌材料比较容易，可通过机械剪切、研磨或加细胞壁溶 解酶解决。 细菌，少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处理；大量 材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。 酵母细胞壁厚较难对付，过去多用自溶法，现在可采用的 办法有： (1)细胞壁溶解酶处理法； (2)盐振荡法； (3)冷热破壁法。
1.3 基本原理
1.4 分类

按流动相分类，有液相层析和气相层析； 按固定相的形式分类，有柱层析、薄层层析等 按分离过程物理化学原理：分配、吸附。
层析分离方法
层析方法 分离依据
吸附层析
分配层析 离子交换层 析
吸附剂对不同物质的吸附力不同
各组分在两相中的分配系数不同 利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团） 对各种离子的结合力不同
凝胶层析
亲和层析 层析聚焦
利用流动相中各种组分的相对分子质量不同
利用生物分子与配基之间的专一而又可逆的亲 和力不同 两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性 结合在一起
二、吸附层析
利用吸附剂对不同物质的吸 附力不同，是应用最早的层 析技术。
三、分配层析：各组分在两相中的分配系数不同 分配系数：溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到 平衡时，该溶质在两种溶剂中的浓度的比值。 纸上层析 分配薄层层析 分配气相层析
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
需要考虑的因素
1.
pH 不应超出酶的稳定范围； 远离待抽提酶的等电点。 兼顾到有利于切断酶和细胞内其它成分间 可能的联系，从这点考虑以选用pH4—6 为佳。

2. 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解 度，所以抽提液一般采用等渗盐溶液。 最普通的加0.020—0.050M的磷酸缓冲液、 0.15MNaCl等。 少数情况用水抽提效果亦佳. 3. 其它 在破细胞后，某些亚细胞结构也往往受到损伤， 这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。为 此，有时还需要在抽提液中加入某些物质。


总体积 蛋白浓 蛋白总 (ml ) 度 量 (mg/ml) (mg) 粗无细胞 1000 抽提液 硫酸铵分 级 凝胶层析 离子交换 层析 250 25 5 12 12000
酶浓 比活力 度 (u/mg蛋 (u/ml) 白) 5 0.416
产率 总活 力 (%) (u) 5000 100
提纯 倍数

将这类配基偶联固定于样品中，能迅速而有选择性地将相 应的酶分子从溶液中分离出来。
常用的亲和介质及专一性配体
根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：
共价亲和层析 疏水层析
一、生物 材料的 破碎
细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
JY92-II D超声波
细胞粉碎机
高 压 细 胞 破 碎 机
1）机械破碎 2）物理破碎
细 胞 破 碎 珠
3）化学破碎
4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 捣碎法 研磨法 匀浆法
二、抽提

细胞破碎后，可采用两种方式进行抽提：
抽提条件的选择：
普遍抽提和先后用不同溶剂进行选择性抽提。

一般用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 使用的溶剂或溶液 0.02～0.5mol/L的盐溶 液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶
酸溶液提取

就阳离子来说，一价盐通常比二价盐有效； 阴离子则相反，二价盐比一价盐好。 符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。 硫酸铵最常用。
硫酸铵沉淀优点

溶解度大，溶解的温度系数小(0℃，706克 ／升；25℃，767克／升) ；
稳定性好，高浓度低温对蛋白构象有稳定 作用； 低格低廉，可大量使用。


饱和度调整
二、酶纯化过程的三个ຫໍສະໝຸດ 段 粗蛋白(crude protein)
采样 破细胞 提取全部蛋白，多用盐析沉淀法。
部分纯化(partially purified) 初步的纯化，使用
各种柱层析法。
均质纯化(homogeneous) 目的酶的进一步精制，
可用制备式电泳或HPLC。
第二节 破碎与提取

常用的有：纤维素离子交换剂、交联葡聚糖离子交换剂、 琼脂糖离子交换剂。
离子交换剂的选择依据
首先是待分离酶(或蛋白)的稳定性 酶在低于其 pI 的 pH 条件下稳定，可选....... 在相同的条件下，pI>pH 时，pI 越高，越容易 被......

运用

酶在低于其pI的pH条件下稳定，可选....... 在相同的条件下，pI>pH时，pI越高，越容 易被...... 试设计利用离子交换剂分离一种含等电点 分别为 4.0、6.0、7.5 和 9.0 的蛋白质混合液 的方案，并简述理由。
选择性变性沉淀 选择一定条件使某些杂质变性沉淀，而不影响所需酶
1.盐析法

是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。
根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差 别而建立的一种纯化方法。
1) 盐析法的原理：

2) 产生盐析作用的原因

等电点与环境 pH 的关系
提高盐浓度增加蛋白质的溶解度----盐溶
对酶容易引起变性失活，对温度要求严格

其它沉淀方法
3 4 5
共沉淀法 等电点沉淀法 选择性沉淀法
第四节 层析分离
一、概述
1.1 定义

混合物中各组分的物理化学性质不同，当流动相流经 固定相时，各组分的移动速度不同，从而使不同的组 分分离纯化
1.2 发展

纸层析 薄层层析
柱层析 样品容量不断增大


有机溶剂沉淀法应考虑的因素
(1)温度
操作控制在 0℃ 以下，有机溶剂预先冷却到 -15—-20℃。
(2)pH
尽可能靠近待纯化酶的等电点 pH
(3)离子强度
添加适量的中性盐，如5—10％的硫酸铵，有助于提高分离效果
(4)有机溶剂
丙酮的分离效果最好，乙醇和甲醇等也常用。
优缺点

分辨率高于盐析法，不用脱盐
碱溶液提取
PH2～6的水溶液
PH8～12的水溶液
用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶
用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
大多数蛋白类酶都溶于水，而 且在低浓度的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度的升高而 增加，这称为盐溶现象。
1.0
3 9 7
750
11 83 364
3.67
2730
55
8.83
6.酶的纯度检验

当把酶提纯到一恒定的比活时，即可认为 酶已纯化，仍需电泳、层析、离心等方法 对纯化的酶进行纯度检验。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
4. 抽提液的用量： 通常采用原料量的l—5倍，有时为了抽提效 果好些，要反复抽提，液量可能大些。 5. 固体成份除去： 抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多 可用离心法或压滤法除去。
纯化方法的选择
1. 为了获得理想的分离效果应注意：

工作前应对所要纯化的酶的理化性质(溶解度、分 子大小和解离特性)以及酶的稳定性等有一个较全 面的了解。 判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力 测定为准则。 要严格控制操作条件，防止变性。
第三章 酶的分离纯化
内容





概述 破碎与提取 沉淀法 层析分离 电泳 其它分离方法 酶的剂型与保存
细胞结构与酶分布
第一节 概述
一、酶分离纯化的一般原则：
1.切记酶是蛋白质，防止酶变性失活
1)酶纯化一般在低温条件下进行（0～4℃）， 2) 各种溶液应该用缓冲液，pH应调到使酶最稳定的pH。 3) 各种溶液中还可以加入酶保护剂。

强型和弱型交换剂的选择

如果待分离酶的pI偏向极端(小于6或大于 9) 一般应考虑强型交换剂 如果待分离的酶既可应用强型交换剂，也 可用弱型交换剂，应优先考虑选择弱型

六、亲和层析法

根据生物分子间特有的亲和力而建立的纯化方法
1. 原理:

酶和它的底物(包括辅助因子)、底物类似物或竞争性抑制 剂通常都具有较高的亲和力，能专一而可逆地形成酶—配 基络合物。


2 酶的物理化学性质建立的一般方法： 1）溶解度： 盐析
有机溶剂沉淀法 选择性沉淀法 共沉淀法 PEG沉淀法、 等电点沉淀法
2）分子大小差异：凝胶过滤
超过滤 离心 超离心
3) 电学、解离特性差异：吸附 离子交换 电泳（区带、等电聚焦） 聚焦层析 疏水层析 高压层析(HPLC)
4) 稳定性差异：
基质 电荷基团 反离子
2. 离子交换剂的分类
A 疏水性离子剂：基质是人工合成的、与水结合力 较小的树脂物质

按电荷基团的性质可分为阳离子交换剂(反离子带正电)和 阴离子交换剂(反离子带负电) 每种包括强、中、弱三种电荷基团
B 亲水性离子交换剂 ：基质是天然的或人工合成的， 与水结合力较大的物质。

盐离子与蛋白质表面具相反电性的离子基团结合， 形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白 质分子之间电排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集 起来。
中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生 水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露疏水区域，由 于疏水区域的相互作用，使其沉淀。

3) 盐析剂的选择

薄层层析
四、凝胶过滤(层析)法
1. 原理

小分子物质进入凝胶内 部，大分子物质被排阻 在外。
分配系数
Ve Vo K Vt Vo


由亲水的线状聚合物通过交联剂交联、或通过聚合物自 身缔合组成具有网眼结构的胶粒物质。 常用的凝胶：
葡聚糖凝胶、琼脂凝胶与琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶
2. 胶的选择
蛋白浓度应在1mg／ml以上
(3)蛋白质浓度

5) 盐析法的特点

优点：简便、安全(大多数酶在高浓度盐溶 液中相当稳定)、重现性好。
缺点：分辨率低，纯度提高不显著，同时 为了下一步纯化有时还需脱盐。

2.有机溶剂沉淀法

原理: 酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同
降低溶液的介电常数，蛋白质分子问的引力增加， 溶解度降低。 部分地引起蛋白质脱水而沉淀。

加入固体盐。不增大 溶液体积。 饱和溶液。原溶液体 积不大。 透析平衡法
541 S2 S1 g 1 0.3 S2

100 ( S2 S )1 v 1 S2

4) 影响盐析的因素
(1)pH

接近于待纯化酶的等电点。
(2)温度

从酶的稳定性和溶解度看，盐析温度一般以控制 在30℃左右为宜。