香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立

第44卷第4期

2008年4月林业科学SCIE NTI A SI LVAE SI NIC AE V ol 144,N o 14Apr.,2008

香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立

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杜　丽1　庞振凌1　周　索1　曾晓慧1　包满珠2(11南阳师范学院生命科学与技术学院　南阳473000;　21华中农业大学园艺林学学院教育部园艺植物生物学重点实验室　武汉430070)

摘　要:　通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立香樟胚性愈伤组织遗传转化体系。结果表明:以胚性愈伤组

织为受体,能取得比较理想的转化效果;50mg ・L -1的潮霉素对胚性愈伤组织有很好的筛选效果;根癌农杆菌0D 600

为016时,能获得较高的转化率;侵染时间提高为40min 时,对提高转化效率有显著的效果;共培养3d 能够得到较好的转化效率。对转基因香樟愈伤组织进行PCR 检测,结果表明G US 基因已整合到香樟胚性愈伤组织的基因组中。

关键词:　香樟;根癌农杆菌;遗传转化;PCR

中图分类号:S718146;Q94312 文献标识码:A 文章编号:1001-7488(2008)04-0054-06

收稿日期:2007-09-19。

基金项目:河南省自然科学基金(0611033300);南阳师范学院高层次人才科研启动费资助。

3包满珠为通讯作者。Establishment of Agrobacterium 2Mediated T ransformation System

of Embryogenic C alli of Cinnamomum camphora

Du Li 1　Pang Zhenling 1　Zhou Suo 1　Z eng X iaohui 1　Bao M anzhu 2

(11Shool o f Life Science and Technology ,Nanyang Normal Univer sity Nanyang 473000;　21K ey Laboratory o f Horticultural

Plant Biology o f Ministry o f Education College o f Horticulture and Forestry Sciences ,Huazhong Agricultural Univer sity Wuhan 430070)

Abstract :　A genetic trans formation system of embry ogenic calli (Cinnamomum camphora )mediated by Agrobacterium tumef aciens was established.Experimental result indicated that efficient trans formation was obtained w ith embry ogenic calli as acceptor.Hygromycin of 50mg ・L -1was efficient in screening embry ogenic calli.When the OD 600value of Agrobacterium was 016,a high trans formation rate was gained.The in fection time of 40m in ,combined w ith co 2culture time of 3d ,remarkably enhanced trans formation rate.Results of PCR proved that the G US gene had integrated into embry ogenic calli of C .camphora genome.

K ey w ords :　Cinnamomum camphora ;Agrobacterium tumef aciens ;genetic trans formation ;PCR

香樟(Cinnamomum camphora ),樟科(Lauraceae ),常绿乔木,是贵重家具、高级建筑、造船和雕刻等理想的用材,近年来,香樟在园林绿化中的应用越来越多,成为城市中重要的园林绿化树种。作者利用未成熟的香樟合子胚诱导获得胚性愈伤组织,历经3年继代保存,胚性愈伤组织仍具有发育成体胚、体胚再形成植株的能力。香樟的植株再生通常是经过体细胞胚胎发生途径来完成的(杜丽等,2006;Du et al .,2007),但国内外迄今为止尚无关于香樟的胚性愈伤组织遗传转化体系的报道。本文利用现有保存的香樟胚性愈伤组织细胞系,对影响香樟遗传转化的几个因素进行了研究,建立了高效的农杆菌遗传转化体系,为香樟的基因工程育种奠定了基础。

1　材料与方法

111　植物材料

香樟可通过体细胞胚发生途径获得再生植株,本文利用这个再生系统进行遗传转化的研究。以香樟继代保持3年的胚性愈伤组织(胚性系L9)(杜丽等,2006;Du et al .,2007)为试验材料和转化受体。112　胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性试验

将胚性愈伤组织接种于附加不同浓度潮霉素的保持增殖培养基上(MS +110mg ・L -1BA +011mg ・L

-1

2,42D +700mg ・L -1CH ,蔗糖30g ・L -1,琼脂粉为715g ・L -1)(CH :水解酪蛋白),1个月后比较不同浓度抗生

素对外植体增殖的抑制作用,以确定合适的选择压力。试验的潮霉素浓度梯度为10、30、50、70、100mg ・L -1。

试验外植体数不少于30团(直径约5mm )。

113　根癌农杆菌菌株及质粒

试验中所用根癌农杆菌菌株为EH A105,它含有pC AM BI A1301质粒,该质粒携带G US 报告基因和HPT 选择基因,其中G US 基因含有一个内含子,以确保G US 基因只在植物细胞中表达,而不在农杆菌中表达。含有该质粒的农杆菌对潮霉素有抗性。质粒中T 2DNA 区域的结构简图如图1所示

。

图1　质粒pC AM BI A1301的T 2DNA 区结构简图

Fig.1　C onstruction of T 2DNA region of plasm id pCAM BIA1301

114　农杆菌介导的转化

收集培养好的农杆菌菌体用共培养介质(AB +100μm ol ・L -1AS ,表1)(AS :乙酰丁香酮)重新悬浮至

OD 600012～112左右,将愈伤组织置于悬浮液中侵染10～60min ,用灭菌滤纸吸干表面液体,一段时间后取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液,并在超净工作台上将浸泡后的材料吹至半干(20～30min ),后接入胚性

愈伤组织共培养培养基(MS +110mg ・L -1NAA +1000mg ・L -1ME +100μm ol ・L -1AS )(ME :麦芽提取物)

中,将上述接种物置于黑暗条件下培养1～6d 。

对于胚性愈伤组织的转化条件优化,本研究试验了根癌农杆菌EH A105ΠpC AM BI A1301的菌液浓度(OD 600=012、014、016、018、110、112),共培养天数(1、2、3、4、5、6d ),侵染时间(10、20、30、40、50、60min ),对遗传转化的影响。检测其中的某个因素时,其他因素的水平采用OD 600为016,共培养天数为3d ,侵染时间为40min ,共培养结束后用外植体G US 的瞬间表达量的多少确定转化条件的适宜程度。

表1　AB 液体培养基的组成T ab.1　Composition of liquid AB medium 组成C om position

浓度C oncentration K 2HPO 4

3g ・L -1NaH 2PO 4

1g ・L -1NH 4Cl

1g ・L -1M gS O 4・7H 2O

013g ・L -1K Cl 0115g ・L -1CaCl 20101g ・L -1FeS O 4・7H 2O 215mg ・L -1葡萄糖G lucose 015%115　脱菌和选择培养

试验中测试了不同浓度的潮霉素(50mg ・L -1和70mg ・L -1)和300mg ・L -1头

孢霉素组成的选择培养基(MS +110mg ・L -1NAA +1000mg ・L -1ME )对诱导

G US 基因转化的抗性愈伤组织的影响,该试验设计2次重复,每次重复采用至少

50个外植体(5个培养皿,10团外植体Π皿),25℃黑暗条件下选择培养,6周后进行抗性愈伤组织诱导率(产生新鲜愈伤组织的外植体数Π每个重复的外植体总数×100%)统计。此后,诱导出的新鲜抗性愈伤组织在含有50mg ・L -1潮霉素和300mg ・L -1头孢霉素的选择培养基上每3周继代1次进行抗性愈伤组织的增殖

培养,25℃暗培养。

116　抗性愈伤组织的GUS 基因瞬间表达及PCR 检测转化共培养后对转化受体进行G US 染色,检测转化瞬时表达率,可初步判

断农杆菌对受体组织的侵染效率。检测G US 基因在转基因愈伤组织中的表达,取未转化的同步材料为阴性对照。胚性愈伤组织反应后可直接观察,G US 基因瞬间表达呈阳性者可在肉眼下观察到蓝色反应,然后统计G US 基因瞬间表达率(有蓝色反应的外植体数Π外植体总数)。试验重复3次,每次外植体总数不少于30粒。

香樟胚性愈伤组织DNA 的提取采用CT AB 少量提取法。根据HPT 基因序列,设计一对特异引物为:5′-CG T ,CTG,T CG,AG A ,AG T ,TT C -3′和5′-T AC ,TT C ,T AC ,AC A ,G CC ,AT C -3′,琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段范围如图5所示。

2　结果与分析

211　胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性分析

研究了10～100mg ・L -1

不同潮霉素浓度对胚性愈伤组织增殖的影响。将继代培养的胚性愈伤组织接种到含潮霉素的保持培养基上,观察和记录在不同选择压力下培养4周后的生长结果。随着培养基中潮霉素

浓度的增加,具有新生长的愈伤组织的比例显著降低,10～30mg ・L -1压力下,4周后虽然有部分愈伤组织逐

渐死亡,但仍有部分愈伤组织存活下来并能继续生存下去。当潮霉素浓度达到70mg ・L -1或更高时,从接种5

5　第4期杜　丽等:香樟胚性愈伤组织遗传转化体系建立