培养基设计

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2、按物理状态分
1）固体 适于菌种和孢子的培养与保存，传统发酵食品的生产， 2）半固体 也广泛应用于有子实体的真菌类，如香菇、木耳等的生 产； 琼脂0.5%-0.8% 近年来由于机械化程度的提高，在发酵工业上又开始 3）液体 应用固体培养基进行大规模生产，其组分常用麸皮、大 主用于鉴定细菌、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测 定等 米、小米、木屑、禾壳等。 发酵工业大规模使用的培养基
制糖的结晶母液，它是制糖工业的副产物;
含有丰富的糖、氮类化合物、无机盐和维生素等，是微 生物发酵培养基价廉物美的碳源; 糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达45-50%。水分含量：1836%。粗蛋白质含量2.5-8%，粗灰分4%-12.5%。
糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，二者在糖的含量和无机盐 的含量上有所不同，即使同一种糖蜜由于加工方法不同其成 分也存在差异，因此使用时要注意。
许多真菌 许多真菌 许多真菌 许多真菌 许多真菌 许多真菌 绳状青霉 产气杆菌 米曲霉 泡盛曲霉 曲霉、桔青霉等 栖土曲霉 筋状拟内胞霉 真菌 绿色毛霉
酶活力增加倍数
20 16 10 4 4 6 20 1.5 2.87 2.50 2-4 1.6 1.2 4.4 2
纤维素酶 蔗糖酶 -葡聚糖酶 木聚糖酶 淀粉酶 脂酶 右旋糖酐酶 普鲁兰酶 大豆酒精提取物（2%） 蛋白酶 脂肪酶 植酸质（0.01%-0.3%) 蛋白酶 洗净剂LS (0.1%) 蛋白酶 聚乙烯醇 糖化酶 苯乙醇(0.05%) 纤维素酶 醋酸+ 维生素 纤维素酶
纯葡萄糖、水解淀粉 纯乳糖、乳清粉 大麦、木薯、红薯、玉米、马铃薯等 甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖等
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葡萄糖
最易利用，几乎所有微生物都能利用 葡萄糖常作为培养基的一种主要成分。
但过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以至培
养基中的溶解氧不能满足需要，抑制微生物的生长
和产物的合成。
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糖蜜
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淀粉
多糖，也是常用的碳源;
需经胞外酶水解成单糖后再被吸收利用;
使用淀粉可克服葡萄糖代谢过快的弊病，价格也比较低廉， 在发酵工业中被普遍使用。 常用的淀粉为玉米、甘薯、马铃薯、木薯淀粉。
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2、油和脂肪
油和脂肪也能被许多微生物作为碳源和能源 这些微生物都具有比较活跃的脂肪酶，在脂肪酶的作用下， 油或脂肪被水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，进一步 氧化成CO2和H2O，并释放出大量的能量。 当微生物利用脂肪作为碳源时，要供给比糖代谢更多的氧， 不然大量的脂肪酸和代谢中的有机酸会积累，从而引起pH的下 降，并影响微生物细胞中酶的活力。 常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等
◆
◆
微生物对磷的需要量一般为0.005～0.01mol/L 硫酸镁 镁离子能提高一些氨基糖苷类抗生素产生菌对 自身所产的抗生素的耐受能力，如卡那霉素、 常用K3PO4、Na2HPO4 、NaH2PO4 链霉素、新生霉素等产生菌。 钾不参与细胞结构物质的组成 钾盐 是许多酶的激活剂 微量元素 需量微少，但又不可缺少 硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组 菌体生长所需钾量约为0.1g/L(以K2SO4计) 成成分 一般作为碳、氮源的农副产物天然原料中， 本身含有，不必另加 硫是构成一些酶的活性基团 某些金属离子，特别是汞离子和铜离子，具 硫酸镁加入培养基中，在碱性条件下会形成氢 有明显的毒性 氧化镁沉淀，配料时要注意。
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促进剂不是前体或营养物 可影响正常代谢，或促进中间代谢产物的积累，或提高 次级代谢产物的产量
例如
◇ 巴比妥可增加链霉素产生菌的抗自溶能力，推迟自溶时间， 增加链霉素积累。
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促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的。 如在酶制剂生产中，有些促进剂本身是酶的诱导物；
有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧 的接触从而促进酶的分泌与生产，
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氮源物质常对培养液pH产生影响 (NH4)SO4 2NH3 + H2SO4
NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH
反应中所产生的NH3被菌体作为氮源利用后，培养 液中就留下了酸性或碱性物质。
在常用的无机氮中，硫酸铵被菌体利用后会使培 养液的pH下降，为生理酸性物质； 硝酸钠被同化时则引起培养液pH上升，为生理碱性 18 物质
◆
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六、前体 (precursor)
概念：
——指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物 在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构 并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大 的提高。
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发现：
最早是从青霉素的生产中被发现的。 加入玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml； 玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从 而提高青霉素G的产量。
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2.发酵培养基的成分及来源

碳源（能源）、 氮源、 无机盐、 生长因子 水 -----前体 -----产物促进剂和抑制剂等。
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一、碳源

一、碳源
凡是作为微生物细胞结构或者代谢产物中 碳架来源的营养物质，都称为碳源。
主要功能： 1）为菌体的生长繁殖提供能源和合成菌体所 必需的成分； 2）为合成目的产物提供所需的碳元素成分
4) 酵母
酵母膏、酵母浸出液、酵母粉
5）其他
牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含 有丰富的生长因子
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四、水
生理功能：
1）是微生物机体的重要组成部分
2）进行代谢反应的介质
3）营养物、代谢物、氧气等必须溶解于水后才能通 过细胞表面进行正常的活动；
4）水的比热高，能有效吸收代谢过程中放出的热， 使细胞内温度不致骤然上升；同时水又是热的良导体， 有利于散热，可调节细胞温度。
a) 以干麸皮：水：HCl=4.6:26:1配比混合，装入水解锅中以 0.07～0.08MPa表压加热水解70～80min。
b) 以干麸皮：水=1：20，用盐酸调pH值1.0，以0.25MPa表 压加热水解20min。然后过滤取滤液。
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3）糖蜜（molasses） ◇ 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等 有机氮含量较低
也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；
有些促进剂的作用是沉淀或鳌合有害的金属离子。
各种促进剂的效果除受菌种、菌龄的影响外，还与所用的 培养基组成有关，即使是同一种促进剂，用同一菌株，生产同 一产物，在使用不同的培养基时效果也会不一样。
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2、抑制剂
抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致 可以改变微生物的代谢途径。
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对于发酵工厂来说，恒定的水源是至关重要的， 因为在不同水源中存在的各种因素对微生物发酵代谢 影响甚大，特别是水中的矿物质组成对酿酒工业影响 甚大。
水源质量的主要参数包括pH值、溶解氧、可溶性固 体、污染程度以及矿物质组成和含量。
对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成分一致清 洁的水。
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前体 苯乙酸及其பைடு நூலகம்生物 苯氧乙酸 氯化物 氯化物 正丙醇 丙酸盐 -紫罗酮 -氨基丁酸 邻氨基苯甲酸 甘氨酸
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七、促进剂和抑制剂
1、促进剂：
促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体， 但加入后却能提高产量的添加剂。
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各种促进剂对产酶的促进作用
添加剂
Tween (0.1%)
酶
微生物
如酵母厌氧发酵中加入亚硫酸盐或碱类，可以使酒精发酵受 到抑制，而转入甘油发酵
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某些代谢产物的抑制剂 产物 链霉素 去甲链霉素 四环素 去甲金霉素 头孢霉素C 利福霉素B 被抑制的产物 甘露糖链霉素 链霉素 金霉素 金霉素 头孢霉素N 其他利福霉素 抑制剂 甘露聚糖 乙硫氨酸 溴化物、硫脲 硫磺化合物、乙硫氨酸 L-蛋氨酸 巴比妥药物
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空气净 化设备
嫌气发 酵罐 好氧反 应器
动植物 细胞培 养反应 器
原料预处理 及固体物料 输送设备
空气 净化
培养基 配置灭 菌设备
离心与 过滤
发酵 设备 分离 提纯 设备
固体培养 反应器
蒸发与 结晶
生物反 应器放 大
干燥 蒸馏
2
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发酵生产的一般流程
菌种 培养基 空气 灭菌 过滤 扩大 培养
产品 下游 提取
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发酵培养基的设计与优化
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设计发酵培养基的四个要求：
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一、培养基的类型 培养基是指利用人工方法配制的供微生物、
植物和动物细胞生长繁殖或积累代谢产物的
各种营养物质的混合物。
培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合
成、产品的质量和产量、产品的分离精制都
有重要的影响。
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1、按培养基成分
1）合成培养基
所用原料的化学成分明确、稳定 如葡萄糖、硫酸铵 2）天然培养基 用于实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、 选育 原料是一些天然动、植物产品 如花生饼粉、蛋白胨、 菌种、遗传分析定量研究工作；在生产某些疫苗的过程中， 3）半合成培养基 牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、玉米浆等 为了防止其他蛋白质等杂质掺入，也常用合成培养基；
来源广泛（大多为农副产品）、营养丰富、价格低廉、 既含天然成分，又含纯化学试剂 营养单一、价格较高，不适于大规模生产 适于工业化生产 发酵工业中使用的培养基绝大多数是半合成培养基
一般不需要另加微量元素、维生素等物质
由于成分复杂，不易重复，如对原料质量等方面不加 控制会影响生产稳定性
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常用的碳源:
糖类
油脂 有机酸 低碳醇等 特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解 物或氨基酸等也可被微生物作为碳源使用。
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1、糖类
发酵培养基中使用最广泛的碳源;
主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉糊精等
工业上常用的糖类及来源 糖类 葡萄糖 乳糖 淀粉 蔗糖 来 源
淀粉水解糖的制备 是发酵生产的一项 重要工艺，将在后 面详细介绍
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大多数前体，例如苯乙胺对微生物的生长有毒性， 以及菌体具有将前体氧化分解的能力，因此在生产中 为了减少毒性和增加前体的利用率，常采用少量多次
的流加工艺。
苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%。
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产品 青霉素G 青霉素V 金霉素 灰黄霉素 红霉素 核黄素 类胡萝卜素 L-异亮氨酸 L-色氨酸 L-丝氨酸
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3、烃和醇类
随着石油工业的发展，发酵工业的碳源也有所扩大。 正烷烃（一般指从石油裂解中得到的14-18碳的直链烷烃混 合物）已用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素和酶制剂的工 业发酵中。
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二、氮源
无机氮源
铵盐、硝酸盐等 （由于细胞内的含氮物质都以氨基或亚氨基的形式存在，故 铵态氮可以直接用于合成细胞物质；而硝态氮需还原成氨后 才能被利用） 有机氮源 豆饼（粕）粉、花生饼粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵母粉、玉米 浆、尿素等
五、无机盐和微量元素
主要无机元素：磷、硫、钾、钠、钙、镁、
铁等。
微量无机元素：钼、锌、钴、铜、硼、溴
等。微量无机元素需求量很少，但往往会 强烈刺激微生物的生长发育。
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◆
2+是许多重要酶（如己糖磷酸化酶、异柠檬 Mg 磷是某些蛋白质和核酸的组成成分 磷酸盐 酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂 磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用
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提供生长因子的农副产品原料 1）玉米浆（ corn steep liquor, CSL）
◇ 用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液 的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副 产品 ◇ 虽然主要用作氮源，但它含有丰 富的氨基酸、核酸、维生素、无机 盐等，常用作为提供生长因子的物 质。
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2）麸皮水解液 可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等。营养成分比玉米浆少。 用量一般为1%（以干麸皮计）左右 水解条件：
无机氮源和尿素、玉米浆等可被迅速利用，为 速效氮；
蛋白质氮则需先水解成肽和氨基酸后才能被吸收利用，
属迟效氮
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三、生长因子
概念：
微生物生长不可缺少的微量有机物质。 类别：
维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶及其衍生物
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不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成 这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌为生 物素缺陷型，以生物素为生长因子。 脂肪酸＋甘油磷酸 生物素：B族维生素的一种，又称维生素H ╰╯ 或辅酶R。是合成脂肪酸所必需的。 磷脂＋蛋白质 脂肪酸的生物合成： ╰╯ 利用乙酰CoA在乙酰CoA羧化酶（辅基为 生物膜 生物素）催化下合成。