人类基因组DNA提取

三、DNA的浓缩不同方法： 1.固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋外敷PEG至合适量 2.丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇， 但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积。 3.乙醇或异丙醇沉淀：（1）需要阳离子盐的存在，醋酸钠 最常用,NaCl对含SDS样品好，NH4Ac去除dNDP好。 PiCl沉淀RNA好，但不能用于反转录前。（2）沉淀温度 与时间；0℃一4℃，12000g，10分钟，小于100bp DNA需超速离心。 4.精胺沉淀法：与DNA结合后使DNA结构凝缩沉淀，需在 无盐或低盐溶液。
断所用的材料为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞。
基因组DNA提取主要步骤
不同组织细胞基因组DNA提取方法有所不同，分离方法也 有所差异，但原理相似，因此他们具有共同的步骤： 一、样品准备： 1.生物组织： （1）最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存70℃或液氮 （2）液氮冷冻敲碎研磨 （3）组织匀浆法 （3）液氮匀浆法 2.培养细胞 悬浮生长细胞：1500g离心，4℃10分种收集细胞 单层培养细胞：可用刮棒或胰酶消化后离心收集 3.血液样品
2.疾病基因的定位克隆
人类基因组计划的直接动因是要解决包括肿瘤在内的人类 疾病的分子遗传学问题。 6000多个单基因遗传病和多种大面积危害人类健康的多 基因遗传病的致病基因及相关基因，代表了对人类基因中 结构和功能完整性至关重要的组成部分。 所以，疾病基因的克隆在HGP中占据着核心位置，也是计 划实施以来成果最显著的部分。 随着人类基因图的完成，3000多个人类基因已被精确地 定位于染色体的各个区域。今后，一旦某个疾病位点被定 位，就可以从局部的基因图中遴选出相关基因进行分析。 这种被称为“定位候选克隆”的策略，将大大提高发现疾病 基因的效率。
试剂说明：酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质 95%乙醇：沉淀DNA
去盐：弃上清，沉淀中加入75%乙醇， 12000rpm*2min 轻轻去上清液，打开离心管室温静置5~10min 储存DNA: 1、短期储存： 4℃或-20℃存放于TE缓冲液中（ TE溶解的DNA，在4℃ 下可保存一年）。 2、长期贮存 在70%乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70℃保存。
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分离蛋白质：加入等体积（0.5ml）的饱和酚，充分颠倒 混匀（不要震荡） 12000rpm*5min，上层水相转移至新的离心管 加入等体积氯仿/异戊醇，等体积混匀 12000rpm*5min（去除蛋白质和SDS沉淀），上层水 相转移至新的离心管 沉淀DNA：加入2倍体积95%乙醇颠倒混匀， 12000rpm*10min
提取基因组DNA原理
1.真核生物DNA一般存在于细胞核染色体上以及线粒 体上，基因组DNA一般又称核DNA。
2.哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA，除
特殊要求外，白细胞、肝或脾组织是最常用的材料。 3.原始材料较少或较难获得时，还必须经过细胞培养 来获得足够量的细胞;有时为了简便易行起见，还可以无 创伤地采集材料，如用口腔上皮细胞、发根细胞。产前诊
防止核酸的生物降解：
核酸酶百度文库预防
常用方法：
人类外周血中提取基因组DNA方法 从人全血中提取基因组DNA的方法 人类口腔黏膜上皮细胞提取基因组DNA方法 无限增殖化人类B淋巴细胞基因组DNA提取方法
从口腔上皮脱落细胞中提取
实验材料与试剂
材料：人口腔上皮细胞 试剂：抽提缓冲液 水饱和酚 氯仿/异戊醇（V/V=24：1） 75%乙醇、95%乙醇 TE缓冲液
二、DNA提取不同方法：
1.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯 。 2.甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与 DNA的结合，透析获得DNA。 3.玻璃棒缠绕法：盐酸胍裂解细胞，裂解物铺于乙醇上，用带钩或U型 玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。 4.异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代乙醇，可去除小 分子RNA（在异丙醇中可溶状态） 5.表面活性剂快速制备法：用Triton X-100A或NP40表面活性剂破碎细 胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。 6.加热法快速制备：加热96℃-100℃，五分钟，然后离心后取上清，可 用于PCR反应。 7.碱变性快速制备：先用NaOH作用20分钟，再加HCI中和，离心后取 上清，含少量DNA。
SDS：SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的去污剂。 它用于确定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝胶电泳。它也可以 用于核酸抽提操作中破坏细胞壁及裂解核酸蛋白复合物。 在较高温度下，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放 出来。在乳液聚合反应中，可充当两相溶液的乳化剂。试 验中用来裂解细胞。 EDTA: 一种重要的络合剂，能和碱金属、稀土元素和过 渡金属等形成稳定的水溶性配合物。试验中用来络合镁等 二价金属离子，防止DNA酶对DNA的降解作用。 蛋白酶K: 一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，用于生物 样品中蛋白质的一般降解。
试剂说明：75%乙醇：去盐，洗涤DNA沉淀 TE溶液：溶解DNA
实验示意图
DNA提取的应用
1.人类基因组计划
人类基因组计划（human genome project, HGP）是 由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的 。 美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日该国 和中国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因 组计划。 这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测 序息。与曼哈顿计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。
四、DNA分离纯化总原则
1、保证核酸一级结构完整 2、排除其他分子的污染： 细胞内：蛋白质、糖类、脂类、RNA 等 提取过程：有机溶剂、金属离子、外源 DNA
基因组DNA提取注意事项
减少化学因素对核酸的降解：
如过量酸碱
减少物理因素对核酸的降解：
强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温高压
实验操作步骤
取材：用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，咀嚼，用分泌 出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，
2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。收集细
胞沉淀。 提取与纯化：加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至 离心管，混匀，65°C温育30min。
继续
抽提缓冲液：由SDS,EDTA,蛋白酶K组成
人类基因组DNA提取
人类基因组
人类基因组是由23对染色体（共46个）所构成，每一个 染色体皆含有数百个基因，在基因与基因之间，会有一段 可能含有调控序列和非编码DNA的基因间区段。 人类拥有24种不同的染色体，其中有22个属于体染色体 ，另外还有两个能够决定性别的性染色体，分别是X染色 体与Y染色体。 基因组DNA是指生物细胞的染色体DNA，基因组DNA是 没有组织特异性的，无论从何种人体组织制得的DNA都是 一样的。 人类基因组DNA主要存在于细胞核内，被组蛋白紧密地包 装起来组成染色体。