荧光原位杂交实验

实验四荧光原位杂交实验

一、实验目的

1.掌握核酸杂交的基本原理、过程和操作；

2.熟练掌握荧光显微镜的使用方法；

3.掌握Image J软件进行图像融合的方法；

4.理解荧光原位杂交技术的应用。

二、实验原理

核酸杂交是以碱基互补为基础、以双链核酸分子在特定条件下的变性和复性为手段，对核酸分子进行定性和定量检测。两条互补的核苷酸单链在特定条件下退火形成异质双链；应用荧光标记的探针与待检测材料中的单链核酸进行特异性结合，形成可悲检测的杂交双链核酸。在显微镜下观察并记录结果。

本实验所用探针是位点特异性标记探针GSP myc，是由SpectrumOrange （552/576）直接标记的荧光DNA探针，长度为200bp，能识别8号染色体的着丝粒部位的α卫星序列。

三、实验器材和试剂

防脱载玻片（premiere公司），医用砂轮，20×20mm盖玻片，橡皮胶，平板加热器，杂交盒，恒温水浴锅，玻璃染色缸，香柏油，荧光显微镜拍照系统，MYC基因扩增检测试剂盒。

四、实验步骤

1.样品处理

1）取细胞培养悬液5ml（107 cell）,2000rpm离心5min，去上清；

2）加入10ml的0.075M KCl，吹打混匀，静置3min；

3）37℃水浴箱低渗30min；

4）加固定液2ml，吹打混匀，室温预固定10min；

5）2000rpm离心5min，去上清；

6）沉淀加固定液5~10ml，吹打混匀，-20℃冰箱静置30min；

7）2000rpm离心5min，去上清。

2.制片

1）取一张干净的载玻片，用砂轮在背面划“一”标记，尽量在中间或靠下

端标记；

2）加50ul固定液重悬细胞，取4ul悬液滴加到载玻片上的标记位置，室温晾干；

3）平板加热器上烤片，60℃30min，显微镜下观察细胞密度；

4）PBS洗涤3min；

5）1%多聚甲醛室温固定10min；

6）PBS洗涤3min；

7）70%、90%、100%梯度乙醇脱水2min；

8）取出玻片，室温晾干。

3.样品和探针同时变性，杂交

1）取出杂交液，混匀，瞬离；

2）加10ul杂交液到杂交区域，迅速盖上盖玻片，轻压使杂交液均匀分布，赶走气泡；

3）用橡皮胶沿盖玻片边缘封片；

4）平板加热器上78℃变性3min，放入湿盒；

5）37℃温箱中杂交10~18h。

4.杂交后洗涤

1）将载玻片取出，轻轻撕去橡皮胶；

2）载玻片放入2×SSC中，1min左右微微晃动，以移去盖玻片，37℃水浴10min，不时上下晃动载玻片；

3）取出载玻片，37℃，0.1%NP-40/2×SSC中6min；

4）取出玻片，70%，90%，100%乙醇各2min脱水；

5）取出玻片，暗处自然晾干。

5.DAPI复染细胞核

室温滴加10ul DAPI复染剂到盖玻片，载玻片目标区域朝下，请放于盖玻片上，轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。

6.荧光显微镜观察拍照

出现2G2O的细胞计为FISH阴性细胞，出现≥3O的细胞计为FISH阳性细胞。

7.Image J进行图片融合处理

五、实验结果

1.实验图片

图1 荧光显微镜观察染色情况

2.统计Ratio值

Ratio=红信号数/绿信号数=15/20=0.75

实验结果为阴性。

六、实验注意事项

1. 实际操作过程中每组至少需要多制备一张片子，细胞滴片可置于无水乙醇中-20℃保存至少一年。剩余的固定过多的细胞悬液可在2~8℃保存1个月，以备必要时重新制片。

2. 当样本难处理时，如细胞厚、杂质过多、信号弱等，可以选择胃蛋白酶消化法进行玻片预处理。

3. 样本应避免与酸、强碱接触或过分受热，防止损坏DNA。

4.若探针杂交前片子会闲置超过2min，请将片子放入盛有100%乙醇的染色缸中保存。

七、实验讨论

在本次实验中，我们通过FISH的方法检测了白血病细胞系HL-60中的c-myc 基因的扩增情况。实验中，有部分样品出现无阳性信号的情况，其可能的原因是酶处理时间不够或者探针没有变性，杂交时间也会影响检测的结果。同时荧光显微镜的分辨率不够或者激发光不合适时也会导致阳性信号无法检出。

实验结果显示背景信号较多。其可能的原因有：1、杂交时间过长，杂交温度过低，探针浓度过高；2、杂交缓冲液和洗涤缓冲液阳离子浓度过高；3、洗涤时间太短，洗涤温度过低；4、细胞核过度膨胀，细胞核分解。

此外，在统计Ratio值时，发现Ratio值低于预期，其可能的原因有：1、探针浓度过低，结合效率不够；2、显微镜分辨率不够高，无法检出所有的阳性信

号，部分阳性信号重叠；3、显微镜只截取了某一平面中的阳性信号点，而细胞核为立体结构，通过立体扫描的方式可以提高阳性信号的检测率。