高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱法 PPT课件
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱分析实验讲义
高效液相色谱分析实验一、实验目的1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法3．评价色谱柱效4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等1．色谱定性分析方法（1）利用保留值与已知物对照定性A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献保留数据定性）2．色谱定量分析方法⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯四、高效液相色谱仪操作步骤1. 流动相的预处理用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
高效液相色谱法指导培训讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
离子抑制色谱（ion suppression chromatography）——调节流动相的pH值， 抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解 度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的 目的。
离子对色谱（ion pair chromatography）— —将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被 测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物， 从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度， 改善分离效果，达到分离目的。
高效液相色谱法指导培训 讲义
胶束色谱(micellar chromatography)
• 表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度） 时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成 胶束（胶粒）。
• 以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束 色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系， 不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。
过滤——用滤膜 脱气——采用
过滤或垂熔漏斗 超声或过滤的方
过滤
法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
高效液相色谱法指导培训 讲义
▪进样阀
高效液相色谱法指导培训 讲义
定量圈 1
正相色谱（normal phase）
流动相极性小于固定相极性的分配色谱 法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:
氨基柱、氰基柱、硅胶柱。 常用流动相为极性小的有机溶剂。
反相色谱（reversed phase）
流动相极性大于固定相极性的分配色谱法 称为反相分配色谱法。常用的分析柱有： ODS( C18)， C8， C2。
高效液相色谱法讲义(包含讲义和实验)
高效液相色谱仪在基础有机化学实验产物分析中的应用第一部分：基础理论部分一、色谱法简介1. 色谱法简史1906年俄国植物学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromatography）的概念。
他在论文中写到：“（原文）植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就像光谱一样，称之为色谱图。
”2. 色谱法分类色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。
根据物质的分离机制的不同，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。
（1）吸附色谱吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
（2）分配色谱分配色谱是利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。
分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。
分配色谱的色谱过程本质上是组分分子在固定想和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。
（3）离子交换色谱离子交换色谱利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。
离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。
固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
（4）凝胶色谱凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。
待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而能够进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
HPLC高效液相色谱实验讲义
自动 进样器
储 液 瓶
溶剂输 送系统
手动 进样阀
色谱柱
数据采集 处理系统
检测器 废液瓶
定量分析
1.归一化法 (Normalized Percent) 2. 外标法 (External Standard) 3. 内标法 (Internal Standard)
定量分析
归一化法定量
将试样中所有组分的含量之和按100％计 算，以它们相应的色谱峰面积为定量参数。如 果试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测 器上都有响应信号，都能出现色谱峰，可用此 法计算各待测组分X的含量。其计算公式如下：
梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制 流动相的组成（如溶剂极性、离子强度和 pH 值等），适用于分析组分数多、性质相差较 大的复杂混合物样品，从而使所有组分都在 适宜条件下获得分离。
4 、检测器
检测器 特点 最低检测限 适用范围
紫外检测器（UV或UVD） 分为:①可变波长型②二 极管阵列检测器
①用于检测有外吸收的物质; ②灵 敏度较高,噪音低,线性范围宽,对流 速和温度波动不灵敏,可用于梯度洗 脱.
用于检测糖、高分子子化合 物、高级脂肪酸、磷脂、维 生素、氨基酸、甘油三酯及 甾体等几十类化合物
4 、检测器
电化学检测器 (ECD) 用于能氧化、还原的有机物质 的检测 1× 10-12g/ml 适用生物胺、酚、羰 基化合物、巯基化合 物等 尤其适合于糖类的检 测
示差折光检测器 (RID) ①属通用型检测器 ,利用组分 10-8g/ml 与流动相折射率之差进行检测 . ②稳定性好 ,操作方便 .③灵敏 度低 ,受环境温度、流动相组 成等波动的影响大 ,不适合梯 度洗脱 化学发光检测器 (CLD) ①高选择性、高灵敏度的新型 检测器 . ②设备简单,自身发 光 ,无需光源 ,价格便宜 Pg级 (10-12)
高效液相色谱实验
高效液相色谱实验The document was prepared on January 2, 2021高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习基础分析化学实验第二版137－140页.目的(1)了解高效液相色谱仪的工作原理；(2)学习评价液相色谱反相柱的方法.原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支.它采用高压输液泵和小颗粒的填料,与经典的液相色谱相比,具有很高的柱效和分离能力.色谱柱是色谱仪的心脏,也是需要经常更换和选用的部件,因此,评价色谱柱是十分重要的.而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常.评价色谱柱的性能参数主要有：（1） 柱效理论塔板数n式中t r 为测试物的保留时间,W 1/2为色谱峰的半峰宽.（2） 容量因子k’式中t 0为死时间,通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间.(3)相对保留值选择因子α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子,而且规定峰1的保留时间小于峰2的.(4)分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间,W b1、W b2分别为两峰的底宽.对于高斯峰来讲,W b =2.为达到好的分离,我们希望n 、α和R s 值尽可能大.一般的分离如α=,R s =,需n 达到2000.柱压一般为104 kPa 或更小一些.本实验采用多核芳烃作测试物,尿嘧啶为死时间标记物,评价反相色谱柱.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i 进样器,440检测器和记录仪组成色谱柱：5 cm × mm ., YWG-C 18H 37 ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20样品I ： 含尿嘧啶 mg ·mL －1、萘 mg ·mL －1、联苯 mg ·mL －1、菲 mg ·mL －1的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液.溶液浓度约为·mL －1；实验内容（1） 准备流动相.将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL 溶液,混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中.（2） 检查电路连接和液路连接正确以后,接通高压泵、检测器和记录仪的电源.设定操作条件为：流速 mL ·min －1,压力上限2′104 kPa 约3000 psi,检22/1r )/(54.5W t n =00r /)('t t t k -=12'/'αk k ＝)/()(2b2b1r1r2s W W t t R +-=测波长254 nm 该仪器检测波长已固定,灵敏度 AUFS,记录仪走纸速度 cm ·min －1,记录灵敏度为5 mV.开启记录仪走纸开关记录基线.并调节基线到合适位置一般为距右10%处.（3） 待基线平稳后建议观察检测器的读数显示,将进样阀手柄拨到“Load ”的位置,使用专用的液相色谱微量注射器取5μL 样品注入色谱仪进样口,然后将手柄拨到“Inject ”位置,同时按一下检测器的标记按钮,同时计时,记录色谱图.（4） 重复3的实验两次.（5） 用同样方法进纯样品的甲醇溶液,确定出峰顺序.（6） 根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽,然后计算色谱柱参数n 、k’,以及相邻两峰的α、R s（7） 将流速降为0,待压力降为0后关机.思考题1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点2. 如何保护色谱柱延长使用寿命高效液相色谱实验II固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量目的（1） 学习固相萃取法处理样品；（2） 用内标法定量.原理固相萃取法是色谱法的一个重要的应用.在此方法中,使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱,样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后,用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来,定容成小体积被测样品溶液.使用固相萃取法,可以使样品中的组分得到浓缩,同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分,从而提高了分析的灵敏度.固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理,而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理.C18固相萃取小柱具有疏水作用,对非极性的组分有吸附作用,因此可以从水中将多核芳烃萃取出来,完成浓缩样品的作用.固相萃取小柱还有其他类型,如极性、离子交换等.内标法的原理是,设在V mL 样品中含有W i g 待测组分i,加入W S g 内标物S,混匀后进样,得组分i 及内标物S 的峰面积分别为A i 及A S .由于峰面积正比于通过检测器的物质量,所以有：W i =f i A iW S =f S A S式中f i 、f S 分别为组分i 和内标S 的校正因子.两式相除,得所以,组分i 的体积浓度为：S Si S i i W A A f f W ⋅⋅=V W A A f V W A A f f VW SS i i S S i S i i '⋅⋅=⋅⋅=fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到.内标法是一种相对测量方法,因此,进样量不必准确,操作条件稍有变化对结果没有什么影响.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成色谱柱：5 cm× mm ., YWG-C18H37ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20 流速： mL·min－1检测波长：254 nmC18固相萃取小柱：2支25 mL移液管：1支50 mL医用注射器：1支10 mL医用注射器：2支2 mL容量瓶：2个样品I：内标标准样,含萘 mg·mL－1、联苯 mg·mL－1、菲 mg·mL－1的甲醇溶液.样品II：内标物溶液.含联苯 mg·mL－1的甲醇溶液.样品III：含萘、菲的被测水样.实验内容（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱,再将2 mL 纯水压过小柱.（2）用移液管取25 mL水样,用50 mL注射器压过小柱,这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上.在小柱下端承接一2 mL的容量瓶,将约 mL甲醇用10 mL 注射器压过小柱到容量瓶中,加入一定量内标联苯溶液,定容摇匀,得到浓缩的样品.（3）按“实验I”中的步骤,进样分析内标标准样和浓缩样品各三次.（4）取平均结果,计算峰面积A s和A i；根据内标标准样的浓度计算f i’,再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度,进而计算出原水样中的浓度mg·mL－1.思考题1.内标法与外标法各有哪些特点本实验为什么采用内标法为好2.为什么要对色谱分析中的样品进行预处理简单列出三个以上的原因.。
第十二章讲义高效液相色谱
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相柱 色谱装置
高效液相色谱仪
例：分离20种氨基酸
经典柱色 谱
柱长：170 cm 柱径：0.9 cm F：30 mL/h t分离: >20 h
HPL C
t分离：1 h
高效液相色谱法与经典液相色谱法
经典液相色谱法
固定相 固定相粒度（μm） 固定相粒度分布(RSD) 柱长（cm） 柱内径（cm） 柱 入 口 压 强 （ kg/cm2 ） 柱效(每米理论塔片数) 样品用量（g） 分析所需时间（h） 装置
液相色谱能完成难度较高的分离工作，因为： ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡
过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提 高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以 上的液体作流动相，增大分离的选择性。
其是在生物学和医学等方面应
用极为广泛。如氨基酸、蛋白
质、核酸、烃、碳水化合物、 分
药品、多糖、高聚物、农药、
子 量
抗生素、胆固醇、金属有机物
等 分 析 ， 大 多 是 通 过 HPLC 来
完成的。
右图是各种HPLC方法的应
用范围及对象
极性增加 不溶于水 非极性
非离子极性
溶于水 离子
吸附
分配
反向分配
正向分配 离子交换
主要由接管、检测器流通池体积及检测器响应时间 等因素所引起。因此，尽可能用短而内径细的接管， 减少流通池体积，改进检测器和记录系统的响应速度 等都是克服柱后展宽的途径
第二节 高效液相色谱仪
一、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐(滤棒，可滤去颗粒状物质) 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
第十六高效液相色谱法演示文稿
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主要分离类型与原理 一、液-固吸附色谱
二、液-液分配色谱 三、化学键合相色谱
四、离子交换色谱 五、排阻色谱 六、亲和色谱(AC)
18
当前第18页\共有30页\编于星期六\8点
16-3 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
对多环芳烃，维生素B、黄曲霉 素、卟啉类化合物、农药、药 物、氨基酸、甾类化合物等有 响应；
12
当前第12页\共有30页\编于星期六\8点
高效液相色谱检测器
信号
流速影响
温度影响
检测限(g/ml) 梯度洗脱 细管径柱 样品破坏 通用型
UV 吸光度
无
小
10-10 适宜 难 无 否
当前第13页\共有30页\编于星期六\8点
常用溶剂的极性顺序：
水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环 > 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯 甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤 油(最小)
溶剂强度指溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力。溶剂强度与溶剂 的极性有关。正向色谱中溶剂极性越大溶剂强度越大。反相色谱反之。
第十六高效液相色谱法演示 文稿
1 当前第1页\共有30页\编于星期六\8点
优选第十六高效液相色谱法
当前第2页\共有30页\编于星期六\8点
2.液相色谱中速率理论
液相色谱高柱效的原因: 以特殊方法用小粒径的填料（3～5um球形）制备色谱柱
高效液相色谱分析 培训课件
（１）高效液相色谱分析的流程由泵将贮液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物则由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器做梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（２）高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有３个组分，Ａ、Ｂ和Ｃ，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分Ａ不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分Ｃ在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分Ｂ的分配系数介于Ａ和Ｃ之间，第二个流出色谱柱。
（２）高效液相色谱的分离过程若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离的目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效应。
（３）高效液相色谱的分类①液－固色谱法：液－固色谱法（液－固吸附色谱法）的固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的，液－固色谱法常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同异构体，但不宜用于分离同系物。
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
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高效液相色谱分析实验
一、实验目的
1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，掌握HPLC的基本操作
2．学习苯-甲苯混合物的定性分析方法
3．评价色谱柱效
4．了解色谱定量操作的主要方法以及各自特点；
5．学习未知样品的定量分析方法。
二、实验原理
不同组分因在互不相溶的流动相与固定相中的分配比不同，当两相做相对运动时，组分在两相之间反复进行多次分配，最终实现不同组分的分离。
色谱仪器的构成：包括高压输液系统、进样系统、分离系统，检测系统等
1．色谱定性分析方法
（1）利用保留值与已知物对照定性
A 保留时间定性 b 峰高增量定性 C 其他方法定性（保留值经验规律定性，文献
保留数据定性）
2．色谱定量分析方法
⑴校正因子：a绝对校正因子；b 相对校正因子。
⑵常见的色谱定量分析方法主要有：
a 归一化法。
特点：简单、方便、准确，但要求所有组分必须全部出峰。
b内标法。
特点：使用相对校正因子定量，结果准确，但操作繁琐，由于需要增加内标物，增大分离的难度。
c 标准曲线法（外标法）。
简单、方便，由于采用绝对校正因子定量，结果受到操作技术因素以及具体色谱条件影响较大。
d 内标标准曲线法。
三、仪器与试剂
LC-1000型高效液相色谱仪P3000A-UV3000型高效液相色谱仪
甲醇(色谱纯) 二次去离子水苯甲苯苯－甲苯
四、高效液相色谱仪操作步骤
1. 流动相的预处理
用甲醇和二次去离子水配成500 mL (V/V=90:10)的甲醇溶液，用0.45μm 有机滤膜过滤，超声波清洗器脱气10～20 min，装入流动相贮液瓶。
2. 苯-甲苯混合试样和苯、甲苯标样的准备
3. P3000A-UV3000型高效液相色谱仪操作
a 依次打开六通阀控制电路、高压输液泵和检测器电源开关；
b 打开CHTX3000色谱工作站，在仪器控制面板中，设置波长，点击！，并开灯；
c打开三通阀，在仪器控制面板中，设置流速为5ml/min, 启动高压泵，排除流路中的气泡。
排气结束后，点击停止按钮，停止高压泵。
d 关闭三通阀，设置最小压力(0.1)和最大压力(20)，并设置实验需要的流速(0.8~1.1ml/min)，启动高压泵。
e 点击采集基线图标（或者在操作中选择采集基线），查看基线运行情况，待运行平稳后，在控制面板窗口中，点击归零，使基线置于零；点击停止采集(此时高压泵正常运行)
f 用平头微量注射器洗涤进样口后，取试液20 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时注入样品，转动阀柄至“Inject”位置，此时软件自动进入“采集数据”模式。
注意！平头微量注射器用甲醇清洗3次后，再用试液清洗3次，避免气泡。
h 待所有色谱峰流出完毕后，按“停止采集”键，保存数据在D盘/仪分实验。
i 点击谱图处理中的定量结果，记录组分的保留时间以及峰面积、峰高等色谱信息。
注意！注射器进不同样品前，使用专用清洗注射器在进样阀的“Load”和“Inject”位置，用流动相清洗几次。
4. LC-1000型高效液相色谱仪操作
a. 依次打开高压输液泵、紫外检测器电源开关；
b. 打开色谱N2000在线工作站，选择通道，建立运行方法；
c. 打开三通阀(逆时针半圈)，按“Purge”排除流路中的气泡。
排气完毕后，按“Stop”键，
停泵，关闭三通阀。
按“Flow”设置流速1.0 mL/min，“Enter”确认。
按“Pmax”和“Pmin”
设定压力。
d. 按“设定”键，检测波长254 nm。
按“↓”键，输入“1”，开启氘灯。
e. 按“Run”键，启动输液泵。
f. 检查基线，零点校正，基线稳定后，用平头微量注射器取试液20 μL，将进样阀柄置于“Load”位置时注入样品，转动阀柄至“Inject”位置，同时点击软件“采集数据”。
注意！平头微量注射器用甲醇清洗3次后，再用试液清洗3次，避免气泡。
g. 待所有色谱峰流出完毕后，按“停止采集”键，保存数据在D盘/仪分实验。
h. 打开N2000离线工作站，调用数据文件(D/仪分实验)，不覆盖当前工作(No)。
查看保留时
间，峰面积，理论塔板数，分离度等参数。
预览、打印图谱和分析结果。
注意！注射器进不同样品前，使用专用清洗注射器在进样阀的“Load”和“Inject”位置，用流动相清洗几次。
5. 结束工作
所有样品分析完毕后，流动相继续流动10～20 min，至基线稳定。
关闭检测器，按“Stop”停泵。
关闭泵电源。
五、实验内容
1. 分别进样苯、甲苯标样和苯-甲苯混合试样，保留时间定性，记录苯-甲苯混合试样色谱谱。
2. a. 分别采集系列甲苯溶液以及未知试样的色谱图，根据保留时间定性，确定甲苯组分峰的位置，并测定各自的峰面积。
b. 根据实验数据，利用外标法绘制标准工作曲线，并计算待测溶液中甲苯的含量。
3. (选做). 改变体系的流速(0.8、1.0、1.2ml/min)，进苯-甲苯混合溶液，记录两组分的保留时间、峰宽以及分离度与流速之间的关系，并结合色谱的原理，简要探讨其原因。
六、思考题：
（1）若进样之后，没有样品峰出现，有哪些可能的原因？
（2）与气相色谱柱相比，为何液相色谱柱一般都很短？
（3）为了提高液相色谱的分离效果，可采取哪些有效措施？。