酶的抑制试验

（六）酶的抑制实验

一、实验目的

理解两大类抑制反应的基本原理和主要特点，并掌握可逆抑制反应确定的原

理和方法。

二、实验原理

根据抑制剂与酶结合的特点可分为不可逆抑制和可逆抑制二种类型，其中可

逆抑制有可分为三种类型：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。

（1）竞争性抑制类型：

酶不能同时与底物和抑制剂结合。动力学特征为：表观米氏常数Km'增加，

Vmax'不变。（Ki 为抑制剂常数，[I]为抑制剂浓度）。

][)][1(][S K I K S V v i

m m ++= )][1('i m m K I K K += （2）非竞争性抑制类型：

抑制剂、底物能同时与酶结合，但此复合物不能进一步分解为产物，Km ’不

变，Vmax’下降。

])[)(][1(][S K K I S V v m i m ++= i

m K I V V ][1'+= （3）反竞争性抑制类型：

抑制剂必须在酶和底物结合后方能与酶形成复合物，但此物不能分解为产物。

Km'、Vmax' 都发生变化。

])[][1(][S K I K S V v i m m ++= i

m K I V V ][1'+= )][1('i m m K I K K += 对于有抑制剂存在的酶促反应，也可采用1/v ～1/[S]作图法，求出Km'、Ki 、

Vmax'，并利用各种可逆抑制类型的动力学特点判断抑制类型。

三、实验材料

1、试剂：

（1）0.05mol/L 柠檬酸缓冲液；

（2）酸性磷酸酯酶原酶液：原酶液用0.05mol/l 柠檬酸缓冲液稀释25

倍左右，

使测定的第五管A405，在0.6-0.7之间；

（3）1.2 mmol/L NPP；

（4）0.3 mol/L NaOH；

（5）10mmol/LKH2PO4

（6）3mmol/LNaF

2、仪器与玻璃器皿：

（1）恒温水浴槽；

（2）可见光分光光度计；

（3）试管、刻度吸管。

四、方法步骤

按表中由上至下操作：

取20支试管按下表编号，1-5号为各不相同底物浓度的样品空白管。各空白管在加入NPP和缓冲液后，先加NaOH，后加酶液。其余各按下表操作。以1-5管中相应的底物浓度做空白，在可见光分光光度计上测A

。

405

总结：KH2PO4为竞争性抑制剂Km’增大Vmax’不变，则 Km’=1.0,Km=0.286 Vmax’=Vmax=4*10-4,Ki=0.4。

NaF为反竞争性抑制剂， Km’增大， Vmax’增大，则 Km’=0.714，Km=0.286 Vmax’=10-3 ,Vmax=4*10-4, Ki=-0.5.说明 NaF对反应有促进作用，或者由于绘制曲线造成的误差，使抑制剂的效果不明显甚至变成激活剂。但从酶活力测定A405来看，NaF反应测得的 A405的确比无 NaF时的 A405值大，可能绘制回归曲线时，应该画非竞争性抑制类型。但是

NaF的1/V值都在无抑制剂的下方，说明不可能为非竞争性抑制类型。总之， NaF的类型存在争议，应多次测定并且用SPSS软件精确分析其回归方程后，才能确定其类型。