逆境胁迫对植物生理生化指标的影响

本科学生综合性实验报告学号姓名学院专业、班级实验课程名称植物生理学实验教师及职称开课学期 2012 至 2013 学年上学期填报时间 2012 年 12 月 15 日云南师范大学教务处编印逆境胁迫对植物生理生化指标的影响作者：（，云南昆明 650092）摘要：对植物产生危害的环境称为逆境，又称胁迫。

干旱是制约植物生长的主要逆境因素，以小麦幼苗在模拟干旱胁迫下，植株体内的生理生化指标会发生变化。

实验采用PEG处理小麦幼苗，对抗氧化酶；脯氨酸；谷胱甘肽；过氧化氢；可溶性糖；丙二醛在植物体内的含量变化进行了研究，实验通过分光光度计分别在不同的波长中测出吸光率，间接计算出其含量，而通过对正常条件下的和逆境胁迫下一定量小麦体内以上各种物质含量的对比，从而了解小麦体内生理生化指标发生的变化。

关键词：小麦（Triticum aestivumLinn）；干旱胁迫；生理生化1 引言干旱是自然界常见的逆境胁迫因素，而且干旱也是植物最容易受到的胁迫之一。

干旱不仅制约植物的生长发育与产量，也会引起植被结构与功能的时空变化。

因此植物对干旱胁迫的适应及机制一直是植物逆境适应策略研究的一个热点【1-3】作物抗旱性的研究方法有多种，适应能力进行了研究：植物对干旱胁迫的适应过程和受伤害程度与干旱胁迫的强度以及植物自身的抗性紧密联系，并从生化代谢、生理功能、形态适应、生长发育以及生物生产力等多种形式表现出来【1-5】。

土壤有效水分状况与植物之间的关系一直是植物生理生态学研究领域的热点问题。

大多数植物在短期或轻度土壤缺水情况下叶片水势下降，气孔关闭。

限制CO2 摄取和光合作用速率：长期严重干旱条件下可限制植物生长,引起形态结构发生变化。

甚至导致植物死亡【6】。

大多实验是在人工控制的干旱或人工模拟干旱条件下进行。

其主要方法是室外盆栽控制水分，苗期室内水培或砂培采用PEG渗透胁迫、人工控制的温室、气候室和培养箱等。

其中，PEG渗透胁迫法简单易行、条件容易控制、重复性好、试验周期短。

本试验采PEG溶液模拟干旱胁迫的方法，研究干旱胁迫对小麦幼苗发芽率、抗氧化酶、脯氨酸、谷胱甘肽、过氧化氢、可溶性糖、丙二醛等生理生化指标含量的变化，并初步探讨小麦的抗逆机理，期望能够应用于农业生产实践中，为干旱农业生产提供理论依据。

2、材料与方法2.1、实验材料小麦种子：购于西山种子公司，供实验备用。

（适宜条件下，选购的小麦种子发芽率较高的，所选购的实验材料较理想的，有利于用作实验材料。

）培养条件：室温，充足水分、充足阳光供给，PEG 干旱处理。

用水：自来水。

2.2、种子生命力（发芽率）的快速测定将待测种子在适宜水中浸种，以增强种胚的呼吸强度。

使显色迅速。

2.3、其它实验种子处理一致如下;小麦种子→ 用0.1% HgCl 2消毒10 min 后 → 用蒸馏水漂洗干净 → 用蒸馏水于26℃下吸涨12 h → 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm ×16cm ）中 → 于26℃下暗萌发60 h → 选取长势一致的小麦幼苗做PEG 干旱处理。

2.4、测定方法2.4.1、种子生命力（发芽率）的快速测定各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验： 其中50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min ），另一半进行TTC 染色（30℃水浴 20 min ） ，计算发芽率。

种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X100﹪2.4.2、逆境胁迫和脯氨酸（Pro ）的积累及测定Pro 的提取：分别取0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA ）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA 洗研钵→5000 rpm 离心10 min →上清液定容至5 mL 。

测定：上清液各2 mL →分别加入( 2 mL 冰乙酸和2 mL 茚三酮试剂)→煮沸15 min →冷却后→5000 rpm 离心10 min （若没沉淀可略此步骤） →分别测定A520计算：用总显V V V W L A ⨯⨯⨯⨯ε520Pro content = (μmol.g -1FW)ε520=3.24/mol.㎝2.4.3、逆境胁迫和丙二醛（MDA ）的测定MDA 提取：分别取0.1 g 实验组和对照组→加入3 mL 10%TCA 和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 10%TCA 洗研钵→5000 rpm 离心10 min →上清液定容至5 mL 。

测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA （用10%TCA 配制） 2 mL →煮沸12 min →冷却后→5000 rpm 离心5 min （视沉淀有无）→分别测定OD450和OD532。

计算：OD450=C1X85.4OD532=C1X7.4+155000XC2其方程得：C1/ (mmol/L) =11.71 OD450 C2/ (mol/L) =6.45 OD532-0.56 OD450式中，C1为可溶性糖的浓度；C2为ＭＤＡ的浓度。

2.4.4、逆境胁迫与H 2O 2的积累及测定H 2O 2提取：分别取0.1 g 实验组和对照组→加入3 mL 50 mM PBS (提取液，pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS 洗研钵→5000 rpm 离心10 min →上清液定容至5 mL 。

测定：分别取上清液各3 mL →加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] 1 mL →摇匀→ 5000 rpm 离心10 min → OD410。

计算：ε410=0.28/mol.㎝2.4.5、植物抗氧化酶活性的（POD 、PPO ）的活性测定抗氧化酶的提取：分别取0.1 g 实验材料→加入少许石英砂和3 ml 提取液（50mmol/L PBS, pH6.0,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP ） → 充分研磨 →转入离心管中→用2 ml 提取液洗研钵→ 5000 rpm 离心10 min →上清液定容至5 用总显V V V W L A ⨯⨯⨯⨯ε410H 2O 2 content =(μmol.g -1FW)ml →用于测定POD 和PPO 酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。

POD 测定：取POD 反应混合液（10 mol/L 愈创木酚，5 mol/L H2O2,用PBS 溶解）2.95 ml ，加入酶液50 ul （空白调零用PBS 取代），立即记时，摇匀，读出反应1 min 时的A470。

PPO 测定：取PPO 反应混合液（ 20 mol/L 邻苯二酚，用PBS 溶解）2.9 ml ，加入酶液0.1 ml （空白调零用PBS 取代），立即记时，摇匀，读出反应 1 min 时的A410。

计算：以每分钟A 值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U ），则：ε470=26.6mM -1㎝-12.4.6、逆境胁迫和谷胱甘肽(GSH)的含量测定 GSH 的提取：分别取0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA ）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA 洗研钵→ 5000 rpm 离心10 min →上清液定容至5 mL 。

测定：上清液各1 mL (空白用5%三氯乙酸代替) → 分别加入2 mL0.1M PBS (pH=7.7) → 1 mL 2 mM DTNB → 25 ℃5 min →测定A412。

计算：ε412=13.6mM -1㎝-12.4.7、逆境胁迫和抗坏血酸(ASA)的含量测定 ASA 的提取：分别取0.1 g 实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA ）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA 洗研钵→ 5000 rpm 离心用总V V t W A ⨯⨯⨯01.0410PPO activities = (U.g -1FW) 用总显V V V t W A ⨯⨯⨯⨯ε470POD activities = (μmol.g -1FWmin -1) 用总显V V V W L A ⨯⨯⨯⨯ε412GSH content = (μmol.g -1FW)10 min →上清液定容至5 mL 。

测定：上清液各0.8 mL (空白用5% TCA 代替) → 分别加入0.8 mL 0.15 M NaH2PO4 (pH=7.4) 和蒸馏水→ 摇匀 → 分别加入 0.8 mL 5% TCA 、44%磷酸和4%联吡啶 → 摇匀 → 加入3%FeCl3 0.8 mL → 37 ℃ 15 min → 测定A525。

计算：ε525=16.5 mM -1㎝-13、结果与分析3.1、种子生命力（发芽率）的快速测定小麦的种子经过曙红染色，不具有生命力的由无色变为红色。

其中50粒小麦种子中，6粒被染成红色，由此可以计算出发芽率：种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X100﹪种子发芽率=44/50X100﹪=88﹪小麦的种子经过TTC 染色，具有生命力的由无色变为红色。

其中50粒小麦种子中，28粒被染成红色，由此可以计算出发芽率：种子发芽率=有生命的种子/测试种子数X ﹪种子发芽率=28/50X100﹪=56﹪数据分析：相同的小麦种子在曙红染色和TTC 染色所测定的种子发芽率分别为88%和56%，差异较大。

分析其原因主要有两个发面，一个原因是曙红染液滴加的过少，以至部分不具有生命力的小麦种子着色较浅；另一个原因是曙红染色时间过短，部分不具生命力的小麦种子着色较浅，从而影响实验的数据结果。

3.2、逆境胁迫和脯氨酸（Pro ）的积累及测定在酸性条件下，脯氨酸和茚三酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520nm 处有较高吸收峰。

数据如下： 用总显V V V W L A ⨯⨯⨯⨯ε525ASA content = (μmol.g -1FW)小麦在干旱胁迫下和正常环境下脯氨酸的含量比较OD520 (mol.g-1FW)对照组0.094 0.290实验组 1.223 3.775由上图表可知：通过对照组与实验组小麦叶片中脯氨酸含量的对比，实验组小麦叶片脯氨酸含量远远高于对照组小麦叶片脯氨酸含量。

实验研究表明：表明小麦幼苗经过干旱胁迫下，植物体通过蛋白质的降解、从头合成和降低脯氨酸脱氢酶活性等途径合成脯氨酸，导致脯氨酸（Pro）的大量积累。

游离脯氨酸可能作为一种调节或者是信号分子来激活很多反应以适应逆境过程【7】。

脯氨酸也是植物遇到逆境的一种可靠的指示器【8】。

脯氨酸的积累还与自由基的非酶清除有一定的相关性，Alia等【9】。

发现离体线粒体中,脯氨酸可减少高光强诱导下自由基的产生。

在向日葵上的研究表明，干旱胁迫下各品种的脯氨酸含量均显著高于对照。