16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

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16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

1.适用范围

本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2.方法和原理

16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常

3.设备和材料

3.1器材

移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal .

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AB3130AB3500、凝胶成像仪：Cycler；VersaDoc MP 4000；基因分析仪：试剂3.2

10×Taq 酶，试剂：TaqDNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR2+，；测序试剂：BigDye TerminatorExoSAP，ddHO等；-Buffer(MgIT)，dNTPs2；BigDye XTerminator Purification Kit5×Sequencing Buffer；耗材3.3TM Optical Micro Amp；离心管：1.5mL、200μL；1000μL移液器吸头：、200μL、10μL TM Well Reaction Plate96-；Micro Amp；Optical Adhesive Film引物3.4

扩增长度名称16SrDNA 序列

正向引物27F -3'5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 500 bp左右第1部分5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 反向引物519R

5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 正向引物357F 部分750bp左右第25'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 1115R

反向引物

5'- AAA CTY AAA KGA A TT GAC GG-3' 926F 正向引物部分左右560 bp第35'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT

T-3'

1492R

反向引物

其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程

核酸提取

产物纯化基因扩增序列比对测序反应

实验方法5.核酸提取：5.1

涡旋震荡混匀的离心管中，挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上30s左右，然后100℃水浴10minO（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取490μL ddH清液与2的DNA 于-20℃保存。

5.2基因扩增

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模以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA备注：DNA模板量通常在100 ng仪上3~5min，最后放于PCR板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却进行反应，这种

冷启动法可增强PCR扩增的特异性。PCR反应条件5.2.2 10min94℃：30s94℃：

30s58℃：30Cyc

45s72℃：5min 72℃：∞4℃：电泳5.2.3

℃电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至60琼脂糖置于称取1g100mL TAE100V1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以左右时，均匀铺板，制成电压进行

琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。5.3产物纯化-IT试剂，混匀。5.3.1每5μLPCR产物加入2μL ExoSAP 15min。PCR仪中，37℃温育15min, 80℃温育放入5.3.2

PCR产物做为下一步测序反应的模板。5.3.3纯化后的测序反应5.4

30Cyc

∞5.4.3测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit) 5.4.3.16μL BigDye XTerminator Solution和每管加入27μL SAM Solution。.

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上2000rpm震荡30min。5.4.3.2放在Eppendorf MixMate

2min×g离心5.4.3.3在离心机上以。1000 96孔板中，放入测序仪中测序。5.4.3.4

每管吸取10μL上清液于序列比对5.5

微生物鉴定系统中进行比对，得MicroSEQ基因测序仪得到的测序结果，在到

菌种的种属信息。关键说明6.

时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑DNA6.1提取细菌基因组后，

10minO 中，混匀，沸水热变性100μL ddH取一菌环菌株，置于2确认模板。必

要时做梯度PCR倍后做为离心3min分离，稀释50PCR 最佳的模板量。及测序

反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然后6.2PCR这种冷启最

后放于PCR仪上进行反应，置于低温冰箱中冷却3~5min，PCR扩增的特异性。

动法可增强包含有丰富的细菌种属的特异序列变化较大，500bp6.316SrDNA序

列的前500bp性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前无法

鉴序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp的全序列扩增和

测序，得到较为全面的别的情况，需要进行16SrDNA 16SrDNA的序列信息。具

体参照附录。

或出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、PCR

离子浓度过高、退火温度过低，及引物聚合形成二聚体。二是Mg2+往往一些来源的酶易出其次是酶的质和量，PCR循环次数过多有关。则不出现，酶量过多有时也会出现非现非特异条带而另一来源的酶物。减低酶量或调换另特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引数。适当一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次。℃变性，65℃左右退火与延伸)(93提高退火温度或采用二温度点法其原因往往由于酶量扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。PCR浓度过高，退火温度过Mg2+dNTP浓度过高，过多或酶的质量差，或调

换另一来源的酶。减少酶量，其对策有：低，循环次数过多引起。度。增加模板量，减少循环Mg2+dNTP②减少的浓度。适当降低浓.

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次数。DNA污染。用RT阴性对照检测是否被基因组模板浓度过