植物组织培养实验报告

植物组织培养实验报告
陈裴
（201101生物科学学号：20114089）
一、实验目的:
1了解MS培养基大量元素、微量元素、铁盐、有机元素、激素母液的配置；
2熟悉工作培养基的配置；
3掌握湿热灭菌法进行培养基和接种工具的灭菌；
4了解植物细胞脱分化原理，学习诱导愈伤组织的接种方法；
二、实验原理：
植物细胞全能性：任何生活细胞都具有产生一个完整个体的全套基因组，在适宜的条件下，细胞具有发育成完整植株的潜在能力。

三、实验步骤
（一）培养基的配制与灭菌
（1）配制培养基的准备阶段
a.取30个培养瓶，用自来水（洗衣粉水）洗净瓶、烧杯等容器，再用蒸馏水把每个培养瓶、烧杯润洗一下。

带晾干后贴上标签
b.在称量纸上分别称取9.0g琼脂，36.0g蔗糖
c.在一个烧杯（250ml）中，依次加入下列各种母液：大量元素母液I，60ml、大量元素II，60ml、微量元素母液，12ml、铁盐母液12ml、有机母液I，12ml、有机母液II，12ml
（2）配置培养基
a.去一个烧杯（2000ml），加入800ml左右蒸馏水，放在电炉子上加热，在蒸馏水温度大约60-70℃时将之前称取的琼脂放入烧杯中，不断搅拌加热溶解待完全溶解后把之前称好的蔗糖和取好的母液直接倒入烧杯
b.加蒸馏水定容到1200ml，加热并不断搅拌熬至溶液呈透明状
c.当温度降到60℃左右时，用HCl和NaOH将溶液pH调至5.8
d.用大量注射器以每瓶40ml培养基分装在培养瓶中，有两瓶标注为对比，直接盖紧培养瓶盖。

另取7个培养瓶，分别向每一瓶中加入200µLNAA和400µL6-BA，盖紧培养瓶盖。

再取7个培养瓶，分别向每一瓶中加入400µLNAA和800µL6-BA，盖紧培养瓶盖。

再取7个培养瓶，分别向每一瓶中加入400µL2,4-D和200µLKT，盖紧培养瓶盖。

再取7个培养瓶，分别向每一瓶中加入800µLNAA和400µL6-BA，盖紧培养瓶盖。

（3）高压湿热灭菌
a.把用剪刀剪好的圆形纸片放进培养皿中，培养皿用报纸包好
b.把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好
c.将培养瓶、培养皿、接种工具放到高温灭菌锅中灭菌121℃，20min。

（二）植物组织的接种及培养
（1）实验前准备工作
a.接种前半小时用75%的酒精喷洒接种室，将培养基及接种工具放入超净工作台台面，开鼓风机，用75%的酒精擦拭超净工作台台面和有关工具，打开紫外灯
b.将绿豆芽分开两半，在流水中冲洗20min，在洗衣粉水中仔细清洗，在用流水冲洗，放到培养皿中
c.洗净双手，用75%酒精擦拭双手
d.接种前关掉紫外灯
（2）外植体灭菌及接种
a.将洗好的豆芽在75%的酒精中浸泡8s后迅速把酒精倒出，迅速加入无菌水漂洗多次，在氯化汞中浸泡8min，并不断搅拌，倒掉氯化汞，用无菌水多次漂洗，在装入无菌培养皿中备用
b.打开包培养皿、接种工具的报纸，将接种工具在75%酒精中浸泡，后用酒精灯火烧，待冷却后用手术刀将绿豆芽子叶切成小块，放到无菌培养皿中待用，取一个培养瓶，打开瓶盖，用酒精灯将瓶口、瓶盖用火烧，将盖子翻转放到瓶身用一只手拿培养瓶，另一只手取刚才切好的绿豆芽子叶，靠近酒精灯迅速将材料接种到培养瓶中，每瓶接种3粒，接种完后盖紧瓶盖，再次用酒精灯灼烧瓶盖
c.待所有培养瓶接种完后，将所有培养瓶放到培养架上在25℃，黑暗下培养
d.清理并整理超净工作台
（三）定期观察培养瓶中材料的生长状况
在超净工作台上操作的不是一个人，所以增大了污染率，另外在操作过程中一些不规范的操作也可能导致污染，总体污染率不是很高。

六、实验失败分析
本实验最终没能成功，可能原因是绿豆芽子叶的全能性较弱，或者是实验处理的时期不对造成的。

七、实验收获
通过这次试验学会了配制培养基和无菌操作的过程，虽然实验还是失败了，但是其中的过程我们每个人都亲手操作了，也学到了很多知识，为以后的实验积累了宝贵的经验和知识。

思考题
一、为什么要配制母液？各种母液的扩大倍数是如何确定的？
答：（1）减少称量极微量药品的误差，保证各物质成分的准确性。

（2）减少每次配制称量药品的麻烦，便于配制时的快速移取。

（3）体积缩小，便于低温保藏。

配制母液时。

母液的浓缩倍数，一方面要根据配方中各种化合物地用量和在水中的溶解度来确定。

浓缩倍数不能太高，否则可能使化合物过饱和而析出，而且浓缩倍数太高时溶解也较慢。

另一方面为方便操作，以整数倍为宜，倍数与用量成
反比，也就是说凡在配制母液时称量化学试剂量少的，配制的倍数可以大到100倍。

用量大的配制的倍数只要10倍。

然后按一般化学混合的要求，错开阳离子（如钙离子）与阴离子（如硫酸根离子）以免混合后产生沉淀。

二、高压蒸汽灭菌之前为什么要将锅内的冷空气排尽，灭菌完毕后为什么不能过早过急地排气，要待压力缓慢降至0才能打开锅盖取物？
答:完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气。

因为空气的膨胀压力大于水蒸气的膨胀压力，所以当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。

此时压力达到0.1MPa了，但温度达不到121℃，使灭菌不彻底。

过早过急地排气，会使培养瓶内压力下降的速度比锅内慢，从而造成瓶内压力大于瓶外压力，使瓶内液体冲出容器外,另外压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢,培养瓶变形。

三、以表格的形式列出配置MS培养基母液200ml(大量元素×50、微量元素×150、铁元素×40、有机元素×80)时,各种母液成分中各化学试剂应称取的量。

如果要配置200ml矮牵牛分化培养基(生芽和生根)所取母液和激素的量(激素的浓度均0.5mg/ml)。

矮牵牛生芽培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼7.5g/L,矮牵牛生根培养基为1/2MS+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L(生根培养基中1/2代表MS培养基中的所有母液的量减半)。

答：激素0.5mg/mL的取0.2mL，0.1mg/mL的取0.4mL
⑶MS培养基铁盐母液的成分及配置方法
答：（1）培养基配置技术及灭菌：包括培养基的选择、母液配制、培养基配制、培养基灭菌。

（2）培养材料的选择及灭菌：供体植物材料选择、外植体的选择和处理。

（3）无菌接种技术：包括接种室的消毒、工作人员用工作服、口罩等的消毒、超净工作台的清洁与杀菌、操作工具的灭菌。

（4）培养技术：主要是培养条件的控制，包括温度、光照、湿度等各种物理环境条件及培养基组成、PH、渗透压等各种化学环境条件。

（5）外植体的接种及培养技术：包括初代培养、继代培养、生根培养和试管苗的驯化与移栽
五、植物组织培养技术中无菌操作应注意哪些事项？
答：（1）不准说话或对着植物材料或培养容器口呼吸
（2）接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中3整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速（4）防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求（5）手不能接触接种器械的前半部分（即直接切割、触碰植物材料的部分），也不能接触瓶盖内壁或瓶口，接种操作时（包括拧开或拧上培养瓶盖时），培养瓶、试管或三角瓶宜水平放置或倾斜一定角度（45度以下），避免直立放置而增大污染机会（6）瓶盖朝上放置，接种完毕立即盖好瓶口（7）接种完一瓶用火灼烧镊子或接种针防止交叉污染（8）种子或分生组织培养，贴放培养基表面，不是插到内部，防止供氧不足（9）已消毒的植物材料接种时不慎掉在超净工作台上，不宜再用。