分子克隆——主要步骤

笔记3 （分子克隆2――主要步骤）

（1）带有目的基因的DNA片段的获得

（2）重组DNA分子的构建

（3）重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选

（4）特定重组克隆的鉴别

分离制备待克隆的DNA片段 --------- 将靶DNA片段与载体在体外进行连

接------- 重组DNA分子转入宿主细胞---------- 筛选、鉴定阳性重组子------- —重组子的扩增。

可以用限制内切酶降解基因组DNA再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRN 做模板，用反转录酶合成互补DNA即cDNA也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA

2. 重组DNA分子的构建：

重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA即目的DNA片段，另一部分是载体DNA用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA它们的基本特征是能够独立复制。如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后

再进行连接。

3. 重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选:

重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达.这个过程叫做转化。大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。除此以外•其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞（在平板上表现为单个菌落，亦称克隆）中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。

4. 特定重组克隆的鉴别:

由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。

此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基

因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。