植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导

植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳
【目的】
1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。

2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。

【概述】
1．聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。

其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。

凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。

聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：
（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。

上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。

如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。

（3）在电场中形成不连续的电位梯度。

在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。

这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。

① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。

承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。

CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2
NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3
C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]n
n 催化剂
② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。

③ 浓缩效应 待分离样品中各组分在浓缩胶中会被压缩成薄层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩，其原因：
a 由于两层胶孔径不同，蛋白质分子向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然增大，速度变慢。

这样，就在两层凝胶交界处使待分离的蛋白区带变窄，浓度升高。

b 在凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl 缓冲液，但浓缩胶pH6.7，分离胶pH8.9，电泳槽中Tris-甘氨酸缓冲液的pH8.3。

在此条件下，HCl 几乎全部电离为Cl -，甘氨酸等电点为6.0，在pH6.7条件下仅有0.1%～1%解离为甘氨酸负离子，大部分蛋白质在pH6.7条件下都以负离子形式存在。

电泳一开始，三种离子同向正极移动，其有效泳动率顺序为Cl -﹥蛋-﹥甘-。

布满胶柱的Cl -迅速跑到最前边，成为快离子，电极缓冲液中的甘氨酸走在最后，成为慢离子。

由于快离子迅速向前移动，在其原来停留的那部分区域成为低离子浓度区，即电导区。

聚丙烯酰凝胶圆盘电泳除具有分离效果好的优点外，还具有设备简单、操作方便、时间短，样品用量少，不易扩散等优点，所以它是鉴定酶和蛋白质的有力工具。

2．同工酶的分离
同工酶是指生物体内能催化统一生化反应，但是由于分子结构及组成不同因而具有不同的化学性质、电泳效应等的一类酶。

因此，可以利用其结构上的差异 用凝胶电泳将其分离。

过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化成蓝色或棕色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有过氧化氢及联苯胺的溶液中染色，即可显色，此有色部位即为过氧化物酶在凝胶中存在的位置。

其反应如下：
【材料、器材与试剂】 NH 22NH NH H
2
N
H 2N NH -2H -2H
无色蓝色中间产物
棕色
1．材料绿豆芽
2．器材
（1）离心机（2）电泳槽（3）5号注射器（4）注射器（5）稳流稳压电泳仪（6）洗耳球（7）研钵（8）微量注射器（9）移液管（10）园盘电泳槽3．试剂
（1）溶液 A 三羟甲基氨基甲烷（Tris）36g，1mol/L HCl48mL,四甲基乙二胺（TEMED）0.24ml，加水定容至100ml，pH为8.9。

（2）溶液B 丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水分别溶解，定容至100ml，pH为8.9（注意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺具有神经毒性，操作中注意安全）。

（3）溶液C 过硫酸胺0.14g，加水定容至100ml（现用现配）。

（4）电极缓冲液 Tris6g,甘氨酸28.6g，加水定容至1000ml，pH为8.3（使用时稀释10倍）。

（5）样品提取液 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液pH为8.0。

（6）40%蔗糖
（7）联苯胺溶液 2g联苯胺溶于18mL文火加热的冰醋酸中，再加入72mL水。

（8）3%过氧化氢
【方法与步骤】
1．制备玻璃管取玻璃管12支，长80～100mm，两端切口磨平，离管口20mm 划一圈水平刻度线，洗净烘干。

另一端套上塞有玻璃珠的乳胶管。

2．制备凝胶 A：B：水：C按1：2：1：4配制
将A、B及水按比例混好后置于三角瓶中，再放在真空干燥器中，同时将C 液也放在真空干燥器中减压排溶液中的气泡。

抽气后立即按比例加入C液，用玻璃棒轻搅使之混合。

用10ml针筒吸混匀的胶液，插入干燥、洁净下端密封的玻璃管中，一边推出溶液一边将针头自管底部逐渐向上移动，要使针尖始终在液面下，胶液灌到20mm的刻度线处。

为防止空气中的氧及凝胶表面形成弯月面，应立即在其表面覆盖5mm水层。

将灌好胶的玻管插入橡皮寒孔中垂直挂于电泳槽的孔内，静止30min。

当见到水层下有一清楚的界面时，表明胶已聚合，用滤纸条吸去水层。

拔掉玻管下的乳胶套。

3．样品的制备称取1g绿豆芽，放入研钵中，加1ml提取液，冷水浴中研成匀浆，用1ml提取液几次洗涤移入离心管，3500rpm离心20min，上清液倒出，以等量40%蔗糖混合备用。

4．装槽点样
（1）装下槽电极缓冲液将稀释10倍的电极缓冲液400ml倒入下槽，安好装有
凝胶柱玻管的上槽，准备点样。

（2）点样用1ml微量进样器吸取样品50ul，沿玻管壁轻轻加到胶面上。

（3）装上槽电极缓冲液将稀释10倍的电极缓冲液100ml倒入上槽，用2ml 注射器吸缓冲液将各玻管注满，加一滴溴酚蓝指示剂，再倒入300ml电极缓冲液，淹没玻管上端1～2cm，连接电极，准备电泳。

5．电泳接好电源（上槽为负极）。

打开电源开关，调节电流到每管1mA左右，15min后调至每管2mA，电泳。

等指示剂前沿距胶柱末端0.5cm处，即可停止电泳。

关闭电源，取出电泳槽。

6．剥胶拔下所有凝胶柱玻管，用5ml注射器注满水，安上10cm长的细针头，沿管壁内侧穿入，边前进，边注水，边转动玻璃管，借水的润滑作用和针头的刮切作用把胶柱剥离，然后用洗耳球轻轻吹出胶柱，放入指形管中。

7．染色向指形管中加入0.5ml联苯胺溶液、9.3ml水和0.2ml的双氧水，淹没整个胶柱，于32℃水浴中保温显色10min，当过氧化物酶同工酶区带出现蓝色后，取出用蒸馏水漂洗，蓝色变为棕色，即得过氧化物酶同工酶的棕褐色酶谱。

8．记录结果倒掉染色液，放入70%乙酸中保存，绘图或照像。

【思考题】
1．聚丙烯酰胺凝胶电泳和醋酸纤维素薄膜电泳的分离效果哪个好，为什么？2．聚丙烯酰胺凝胶电泳时蔗糖的作用是什么？
3．电泳时样品为什么加在负极？
总氮量的测定―――微量凯氏定氮
【目的】
1．学习测定蛋白质样品中含氮量的方法
2．了解氮含量测定的原理及重要性。

【概述】
生物体中的氮包括蛋白质氮和非蛋白质氮两大类。

组成蛋白质的氮称做蛋白质氮，其它化合物中的氮称做非蛋白质氮，主要是氨基酸和酰胺，以及未同化的无机氮等，它们都是小分子化合物，易溶于水，故也称做水溶性氮。

植物体中的含氮化合物以有机氮为主，无机氮含量极少。

蛋白质中氮的含量比较恒定，平均为16%，可通过测定氮的含量推测样品中蛋白质的含量（总氮量×6.25）。

存在于蛋白质或其他含氮化合物中的氮通常用微量凯氏定氮法来测定，其基本原理是含氮化合物例如蛋白质与浓硫酸共热，使其中的氮转化为氨，后者与硫酸结合生成硫酸按。

以甘氨酸为例反应如下：
NH
2－CH
2
－COOH + 3H
2
SO
4
→ 2CO
2
+ 2SO
2
+NH
3
+4H
2
O
2NH
3
+ H
2
SO
4
→（NH
4
）
2
SO
4
反应进行得很慢，因此需加入接触剂（由硫酸铜和硫酸钠或硫酸钾组成，硫酸钾可提高浓硫酸的沸点，增加氧化能力；硫酸铜是催化剂，同时可指示消化的终点），这一步称为消化，所得硫酸铵溶液为消化液。

消化完了，加入强碱（如30%～40%的氢氧化钠）使硫酸铵分解放出氨。

借水蒸气蒸馏法将氨气蒸入硼酸溶液中，氨与酸液中的氢离子结合生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。

用标准盐酸滴定，根据所消耗的标准盐酸的量可换算出放出的氨的量，进而可计算出蛋白质样品中总氮的量。

在发酵工业上，常用此方法测定发酵液中氮源的消耗情况。

【材料、器材与试剂】
1．材料豆粉等含蛋白质的物质。

2．器材
（1）凯氏烧瓶（50ml,8个）（6）玻璃漏斗（4～6cm）
（2）三角瓶（500m1,7 个）（7）洗瓶
（3）微量凯氏定氮仪（8）100ml的容量瓶
（4）滴定管架（9）微量滴定管
（5）10m1量筒（2个）（10）微量酸式滴定管
3．试剂
（1）浓H
2SO
4
(AR)
（2）接触剂硫酸钾－硫酸铜混合物（K
2SO
4
：CuSO.5H
2
O＝5：1）
（3）甲基红－甲烯蓝指示剂（变色范围：酸性为紫红色，中性为灰绿色，碱性为绿色）
①溴甲酚绿乙醇溶液（0.1%）把0.1g溴甲酚绿溶于100ml乙醇中。

② 0.15的甲基红乙醇溶液把0.1g甲基红溶于100ml乙醇中。

③把50ml溴甲酚绿乙醇溶液和10ml甲基红乙醇溶液混合后即得
（4）0.01mol/L的标准盐酸溶液
① 0.lmol/L的盐酸把8.4ml浓盐酸加水稀释到1000ml。

②标定取一个250ml的三角瓶，精确称取0.4～0.5g的硼砂放入该三角瓶内，重复做两份。

分别加入50ml蒸馏水使其溶解，再加入2～3滴甲基红溴甲酚绿指示剂，用0.1mo1/L的盐酸滴定到红色刚出现为止。

记录0.1mol/L盐酸的用量，根据下式计算标准盐酸溶液的实际浓度。

盐酸的摩尔浓度＝g（硼砂质量）／盐酸消耗量× 0.1907
③取适量盐酸溶液加水稀释到0.01mol/L 备用。

【方法与步骤】
1．样品的消化
（1）样品的处理固体样品粉碎、烘干至恒重。

（2）消化取2个凯氏烧瓶，编号为1和2。

在分析天平上称取0.5～1.0mg的样品放入1号烧瓶中（注意要加到瓶底部），再加入0.5g硫酸铜和5g硫酸钾混合接触剂，并慢慢加入20ml浓硫酸。

2号烧瓶中加入0.5g硫酸铜和5g硫酸钾混合接触剂，20ml浓硫酸，作为空白对照。

（3）在每个瓶口放一个小漏斗，置通风橱内，在电炉上加热消化。

瓶内溶液的颜色由棕褐色变为浅蓝色后，继续消化0.5～1小时,至消化液呈透明蓝绿色。

（4）使瓶内消化液冷却到室温。

将1、2号烧瓶中的消化液分别移入100ml的容量瓶内，用燕馏水冲洗漏斗和烧瓶（注意：每次加水要适量，至少冲洗3次）。

最后加水到刻度，混匀备用。

2.定氮装置的安装与清洗在蒸气发生器中加约2/3体积的蒸馏水和几滴浓硫酸、甲基红和沸石。

打开漏斗下夹子，加热至水沸腾，使蒸气通入仪器的每个部分，达到清洗的目的。

在冷凝管下端放置一个三角瓶承接冷凝水。

然后夹紧漏斗下的夹子，再冲洗5min，冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡皮管，蒸馏瓶中的废液由于减压倒吸到收集器中，打开收集器下端的活塞排除废液。

如此清洗2～3次，然后在冷凝管下换放一盛有硼酸指示剂混合液的三角瓶，使冷凝管下口完全浸在溶液内，蒸馏1～2min，观察三角瓶内的溶液是否变色，如不变色，则证明蒸馏瓶内部已洗干净。

移去三角瓶再蒸馏1～2min，最后用蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，关闭电炉，仪器可供测样品用。

3．碱化蒸馏
（1）量取10ml硼酸溶液放入三角瓶中，加入混合指示剂2～3滴，并使冷凝管下端插入硼酸液面下（注意加样前勿打开收集器活塞以免三角瓶内液体倒吸）。

（2）准确吸取5ml样品消化液由小漏斗加入反应室，并以10ml蒸馏水洗涤样品加入反应室，塞紧棒状玻璃塞。

将10mlNaOH溶液倒入小漏斗，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，用少量水冲洗后立即将玻璃塞塞紧，并于小漏斗中加水水封。

（3）关闭收集器活塞，打开蒸气夹，加热蒸汽发生器，进行蒸馏。

三角瓶中的硼酸指示剂由于吸收了氧，由紫红色变成了绿色。

自变色时起，再蒸3～5min，移动三角瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约1cm，并用少量蒸馏水洗涤冷凝管下口外边，再继续蒸馏1min，移开三角瓶。

4．样品滴定用微量酸式滴定管以标准液进行滴定，直至三角瓶中硼酸指示剂混合液由绿色变回淡紫红色为止，即滴定终点，记录盐酸的用量。

5．计算
N×（V
1-V
2
）×100×A
样品含氮量（％）＝—————————————× 0.014
W × B
样品中粗蛋白质含量（%）=总氮量（%）×6.25
式中：N——盐酸的浓度（0.01mol／L）；
V
1
——滴定样品所需的0.01mol/L 盐酸的ml数；
V
2
——滴定空白所需的0.01mol/L盐酸的m1数；
W——样品质量，g；
A——消化液的总体积；
B——每次蒸馏所取的消化液毫升数。

【思考题】
1．样品消化过程中发生的颜色变化是什么？为什么？
2．为什么在消化过程中要加入接触剂？
3．本实验过程中，精确测定的关键步骤是什么？
4．如何判断反应室（即仪器）是否冲洗干净？
5．何谓样品的消化？
6．在定氮仪的反应室内将发生什么化学反应？
粗脂肪含量的测定（残余法）
【目的】
掌握残余法测定粗脂肪的原理与过程。

【概述】
脂类是一类不溶于水但易溶于有机溶剂的一类化合物。

脂肪是由一分子的甘油和三分子脂肪酸脱水缩合而成的化合物，广泛存在于动植物组织中。

用脂溶性溶剂将脂肪从样品中浸提出来，然后将溶剂蒸发出去，称量样品损失的重量，即可求得样品中粗脂肪的含量。

在抽提样品时，通常采用沸点低于60℃的有机溶剂作为脂溶性溶剂，如乙醚、石油醚等。

用乙醚等提取的脂类，除脂肪外，还有游离脂肪酸、有机酸、磷脂、色素等。

所以此法测得的脂肪为粗脂肪。

【材料、器材与试剂】
1．材料花生米
2．器材
（1）电子天平（2）研钵（3）水浴锅（4）电热恒温箱（5）索氏提取器3．试剂无水乙醚
【方法与步骤】
1．仪器安装将索氏提取器各部分组装好，并连通冷凝管的进出水口。

2．样品的制备
（1）取一定量的烘干的花生米于研钵中研磨成粉末状。

（样品去皮）
（2）称取研磨好的样品用电子天平准确称取1～2g（G）。

（3）将样品放入已烘干的滤纸包内，用线系好，电子天平称重（W
1
）。

3．脂肪抽提
（1）将样包装入脂肪抽提器的抽提筒中，倒入无水乙醚，使之刚好超过包高度，连接好抽提器的各部分。

（2）检验抽提装置有无漏气，打开冷凝水，在水浴锅中进行抽提，温度40℃～50℃，抽提6～8小时。

（3）取出样包，在通风处使乙醚挥发，另将抽提器剩余乙醚回收。

（4）将样包放入105±2℃烘箱中干燥2小时，取出放入干燥器，冷却至室温，
再将样包进行称重（W
2
）。

4．计算粗脂肪含量（%）=[W
1－W
2
/G]×100%
【思考题】
1．绘出索氏提取装置图，并标明各部分名称。

2．如果用增重法测定脂肪含量，应称量哪些重量？。