葡萄糖醛酸苷酶活性影响因素的探讨

B-葡萄糖醛酸苷酶活性影响因素的探讨
杨　光　(山东农业大学动物科技学院　泰安　271018)李振清　(滨州职业学院生物工程系兽医教研室)
李建基　(扬州大学畜牧兽医学院)
摘要　探讨实验室条件下人工培植牛黄过程中,温度、pH值、钙、乙二醇等因素对B-葡萄糖醛酸苷酶活性的影响,结果表明,温度升高可显著提高该酶的活性(P<0.01),且在55℃时,其活性比在37℃提高近4.1倍;该酶的最适pH值为7.0;Ca2+在0.5～10m Mo l/L浓度范围内对该酶具有激活作用且与浓度成正比,在10mM ol/L时其激活作用最大;乙二醇在0.3～3M ol/L的浓度范围内对该酶具有激活作用,其最适浓度为1.5Mo l/L。

关键词　大肠杆菌　B-葡萄糖醛酸苷酶　温度　pH值　钙　乙二醇
在人工培植牛黄的研究中,如何提高培植牛黄的产量和质量成为研究的热点。

牛黄中胆红素和胆酸含量是评价牛黄质量优劣的标准,因此促进胆汁中结合胆红素的水解和游离胆红素钙的沉淀是提高牛黄质量的关键。

埃希氏大肠杆菌可以产生B-葡萄糖醛苷酶(B-G酶),可作为牛黄菌种,其酶活性的高低对牛黄产量和质量有重大影响。

目前国内在牛黄菌种的筛选、驯化等方面报道较多,但在如何提高B-G的活性这一方面还鲜有研究。

为了探讨促进B-G活性的因素,为提高培植牛黄的产量和质量提供科学依据,特进行该项试验。

1　材料方法
1.1　牛黄菌种
采用5种血清型的大肠杆菌,编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,其中Ⅰ、Ⅱ组为本院预防兽医学系微生物教研室提供;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组为本课题组保存菌种。

1.2　试剂
beta-GLUCOSIDASE:Worthington,批号, J1K697J;pHenolpHthalein m ono-B-g lucosiduronic acid:SIGM A,批号,229-896-3;酚酞(A.R.):上海化学试剂站分装厂,批号,871217;氯化钙(C. R.):天津市四通化工厂,批号,20020206;乙二醇(A.R.):上海试剂总厂第三分厂,批号,860919;氨基乙酸(B.R.):山东济宁化工研究所,批号, 890118。

1.3　仪器
721-100型分光光度计(上海第三分析仪器厂产)、SY21-Ni型电热恒温水浴锅(北京长风仪器仪表公司产)、1702型电子分析天平(德国产)、7DL -40B型台式离心机(上海安亨科学仪器厂产)、JY99-2D型超声波细胞破碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司产)。

1.4　样品处理
将5种血清型大肠杆菌菌种依次接种于10%、20%、30%、40%、50%、60%的自制胆汁琼脂培养基中进行耐胆汁驯化培养,再经营养肉汤培养基增菌培养后用超声波细胞破碎机处理15min,然后经3000r pm离心5min后,将上所得上清液置于5支试管内保存于-4℃冰箱中,作为酶源进行酶活性测定。

1.5　酶活性测定
酚酞葡萄糖醛酸在B-G作用下分解为酚酞和葡萄糖醛酸,酚酞在碱性溶液中显红色,且红色的深浅与酚酞的量成正比。

通过比色法由标准曲线得出酚酞含量,然后按下式计算酶的活性单位。

酚酞量(L g)
318.33×1000×
1000ml
0.2×
1
120=国际单位B-G活性用每分钟、每升检测样品水解底物释放出10-6mol的酚酞为一个国际单位。

具体操作步骤见表1。

1.6　不同温度条件下酶活性变化的试验
在37℃、40℃、55℃3个温度条件下,用上述方法分别测定样品的酶活性,观察不同温度条件下酶活性的变化,从而确定最适反应温度。

1.7　不同pH值的系列缓冲剂中酶活性变化的试验
在pH= 4.0～6.5的醋酸盐缓冲液、pH= 5.5～8.0的磷酸盐缓冲液和pH=3.0～4.5柠檬酸-磷酸二氢钾缓冲液这3种缓冲液环境中,分别测定样品的酶活性,观察其活性的变化规律,从而确定最适pH值。

4山东畜牧兽医
表1　B -G 活性测定操作步骤
试剂(ml )
空白管标准管对照管测定管1.pHeno l pHthalein mono -B -g lucosiduro nic acid ---0.012.0.2M 磷酸盐缓冲液pH=6.8
0.80.80.80.83.离心后上清液
--0.010.014.55℃恒温箱保温2h 5.75%酒精停止反应
1.0 1.0 1.0 1.06.酚酞标准液(0.1mg /ml )
-0.02--7.pHeno l pHthalein mono -B -g lucosiduro nic acid --0.01-8.0.2M 甘氨酸-N aO H 缓冲液pH =10.4 2.0
2.0 2.0
2.09.加水至5ml,混匀
10.记录光密度(O D 值),波长540nm
以空白管为0
以对照管为0
1.8　不同浓度的氯化钙溶液对B -G 激活作用的试验
在0.5mM ol/L ～16mM ol/L 浓度范围内分别测定样品的酶活性,观察氯化钙溶液对B -G 的激活作用,同时,同一批样品在加入Ca 2+
与不加入Ca 2+的情况下进行活性对比,得到的数据进行t 检验。

1.9　不同浓度的乙二醇对B -G 激活作用的试验
在0.3M ol /L ～3M ol /L 浓度范围内分别测定样品的酶活性,观察乙二醇溶液对B -G 的激活作用。

在55℃、pH =5.5～8.0的磷酸盐缓冲液条件下,加入10mM ol /L Ca 2+和1.5M ol /L 乙二醇后,分别测定5种血清型大肠杆菌B -G 活性。

2　结果与分析
55℃组B -G 活性为109.18±13.88,40℃组B -G 活性为101.30±12.74,两组间差异不显著(P >0.05),但都明显高于37℃组(29.23±10.70),差异显著(P<0.01);55℃条件下,B -G 活性是其在37℃条件下的3.7倍,而40℃条件下,B -G 活性是其在37℃条件下的3.5倍(表2)。

B -G 在pH =5.5～8.0的磷酸盐缓冲液其活性最高,在pH=7.0时达到最高峰值,其最适pH 值为7.0,其余两种缓冲液中均不能达到最高峰值。

Ca 2+
在0.5～10m Mo l /L 浓度范围内对该酶具有激活作用且与浓度成正比。

在10mM ol/L 时其激活作用最大,超过10mM ol/L 后其激活作用反而减弱,反应体系中加入10m Mo l/L Ca 2+
可使
B -G 灵敏度提高22%;同一批样品在加入Ca 2+
和不
加入Ca 2+
的情况下分别测定B -G 活性,差异极显著
(P <0.01)。

表2　不同温度条件下B -G 活性(U /L )测定结果温度(℃)样品数量(n )平均活性(X ±SD )范围371029.23±10.7016.90～41.554010101.30±12.74*89.47～121.6455
10
109.18±13.88*
91.52～130.54
注:表中标有*表示差异不显著(P>0.05),55℃组与40℃
组之间差异不显著(P >0.05);37℃组与其他两组之间差异显著(P <0.01)。

表3　加入Ca 2+和不加入Ca 2+的情况下
分别测定B -G 活性比较(U /L )处理样品数量(X ±SD )范围加入Ca 2+10107.49
±41.1973.15～148.21不加入Ca 2+
10
89.45±34.09
51.93～119.69
注:经检验,加入Ca 2+和不加入Ca 2+两组样品B -G 活性差
异显著,P <0.01。

乙二醇在0.3～3M ol/L 的浓度范围内对该酶具有激活作用,其最适浓度为1.5M ol/L,提高灵敏度47%。

Ⅰ、Ⅱ组牛黄菌种其B -G 活性明显高于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(P<0.01);而Ⅰ、Ⅱ组之间差异并不显著(P>0.05),Ⅲ、Ⅳ之间差异也不显著(P>0.05),但都明显高于Ⅴ组,差异显著(P <0.01),结果见表4。

表4　5种血清型牛黄菌种活性(L /L )
组别ⅠⅡⅢⅣⅤB -G 活性(U /L )
120.20±11.68A
117.30±10.73A
80.41±14.12B
91.52±19.45B
29.11±11.32C
　注:标有相同大写字母的表示差异不显著(P >0.05),标有不同大写字母的表示差异显著(P <0.01)。

5
试验研究
3　讨论与小结
许多研究资料表明,在牛黄形成的过程中,B-G 起着极为重要的作用。

M aki.T指出,B-G在胆汁中作用于结合胆红素(C.B.),使之水解为不溶于水的游离胆红素(U.C.B.)和葡萄糖醛酸,U.C.B.分子上的羧基、亚氨基等配位基团进一步与胆汁中的Ca2+、M g2+等金属离子配位结合,形成络合高分子化合物。

U.C.B.是否形成结石,直接取决于胆汁中U.C.B.与金属离子的浓度。

B-G活性升高可使胆汁中U.C.B.的浓度升高,从而有利于牛黄的形成。

因此,B-G活性是牛黄生产的关键因素。

在以往的研究中,测定B-G活性的反应温度均采用37℃,这样的温度条件下,B-G活性不高,不仅牛黄质量低,而且测定B-G的反应时间长,底物用量大,灵敏度亦低。

本试验中采用55℃作为反应温度,不仅缩短了反应时间,仅用2h即可,而且减少昂贵底物的用量,灵敏度提高3.1倍。

温度的升高使酶的活性升高是由于酶分子的某些基团在此温度下呈现一定的解离状态,有利于酶分子结构的稳定性。

也有学者认为,温度升高可将酶固定于细菌内部,产生固定化作用,使酶稳定性提高,减少了外界因素对酶活力的影响,从而提高酶活性。

正常情况下胆汁中也存在组织源性的B-G,但由于此时胆汁的pH值在中性偏碱范围内,故胆汁中B-G活性不高。

当胆汁被细菌感染后,细菌可将胆汁中结合胆酸分解为游离胆酸,因而游离胆酸浓度升高;同时,在有大量细菌存在、呈淤积状态的胆汁中,细菌的活动还可以分解胆汁中的蛋白质。

这两种因素促使胆汁pH值下降,正是细菌性B-G最适的pH值,B-G活性升高,促使C.B.转化为U.C.B.,后者与Ca2+结合形成牛黄。

程世模等研究发现,在pH<3.0环境下,B-G活性即遭破坏。

宋立新等证明,细菌性B-G在pH=4.5时其活性仅是pH =7.0时的20.66±1.27%。

阎家麒研究发现,天然胆红素牛黄胆囊胆汁和人工培植牛黄胆囊引流胆汁的B-G活性在pH=4.6和pH=7.0时释放的酚酞量均高于正常胆囊胆汁(p<0.01),其中pH=7.0时活性尤为显著。

Dever s证明,当pH值下降至7.0时,细菌性B-G活性最高,这与本试验得到的结果一致。

pH值对B-G活性的影响有两种形式,一是破坏酶的空间结构;另一种是通过改变酶的活性部位各有关基团的解离形式,从而影响酶的活性。

pH降低不仅有利于提高B-G活性,而且由于H+增加促使胆汁中zeta电位下降,但胆红素颗粒产生絮凝,并形成絮团,在黏蛋白作用下絮团相互搭接成网架,网架内颗粒为胆红素钙沉淀。

另外,pH值下降可以导致蛋白质带负电荷减少,zeta电位下降时,蛋白质沉淀速度加快,从而导致胆汁黏度下降,加速半径较小的其他胆汁成分沉降。

因此,pH值降低是牛黄形成的重要条件之一。

关于Ca2+激活B-G的报道极少,Patricia M曾对Ca2+激活鼠肝B-G活性的机理进行研究,认为这种激活作用可能是因为部分B-G是膜结合性的,而Ca2+可促使这部分B-G与膜分离,从而提高该酶活性,但其激活详细机制尚待进一步阐明。

Seiffert等报道了乙二醇对血清中B-G有激活作用,他认为其激活机理是由于乙二醇可与底物的水解产物B-葡萄糖醛酸形成苷式结合,降低了产物抑制效应,从而提高了酶促反应,使酶的活性升高。

(收稿日期:2003-12-05)
猪附红细胞体病并发链球菌病的治疗在猪病临床中,猪附红细胞体与细菌混合感染的病例越来越多,尤以附红细胞体继发链球菌更为严重,该病多在猪受到应激时发生,给养猪业造成很大损失。

1　最急型
个别采食未见异常,采食过程中突然口吐白沫,昏迷死亡。

随后同栏猪也有类似的情况发生,有的体温升高至42℃以上,有的病例耳、四肢末端、尾根处有瘀血斑,治疗不及时或药量不足,发病的当日共济失调。

死亡后体表大面积紫红色,尸僵不全,解剖肠道黏膜出血、瘀血为主,个别病例心脏冠状脂肪,膀胱、肾有出血点,空肠充气,肠壁变薄。

取心脏血液、肝组织涂片,姬氏染色可见到附红细胞体。

病料用琼脂全血培养24h,培养皿中长出均匀一致的小菌落。

取菌落涂片,革兰氏染色镜检,有单个、成对和短链存在的球菌。

2　急性型
突然不食,体温正常,体表未见异常,发病不久共济失调,不及时治疗,多在24h之内死亡。

死猪外观大面积紫红色,脑膜出血,从十二指肠到直肠黏膜出血,部分小肠肠壁增厚。

取心脏血液、肝脏病料涂片,姬氏染色见附红细胞体。

取病料于全血琼脂培养48h,生长出均匀一致的小菌落。

以菌落涂片,革兰氏染色镜检,视野中见单个、成对、短链的球菌,有两个猪场存在长链的球菌。

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6山东畜牧兽医。