诱导多能干细胞

Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
IPS细胞的应用前景
• 用于器官移植 • 建立疾病模型，了解发病机理，如癌症 • 治疗某些遗传病 如：患有镰刀型贫血症的小鼠皮肤成纤维细胞建 立了IPSc，并将其移植到小鼠体内，小鼠的症状 得以缓解。
Cyagen Biosciences Inc.
iPS细胞的鉴定
• 基因表达模式和发育潜能鉴定
ES和iPS细胞基因表达谱基本相同。iPS细 胞具有发育为包括神经组织、软骨和柱状上皮 在内的三个胚层的能力，并能参与生殖系统的 发育，这与ES细胞相同。
制备iPS细胞的细胞来源
• • • • • • • 成纤维细胞（皮肤、骨髓） 神经细胞 角质细胞 外周血来源的细胞 脐带血 脐带、胎盘来源的间充质干细胞 患者来源的细胞
iPS细胞的鉴定
• DNA甲基化：DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性 地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，常见于基因的5‘CG-3’序列。DNA的甲基化可引起基因的失活。 • CpG岛：CpG即核苷酸对，CpG双核苷酸在人类基因 组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保 持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。 CpG岛 主要在基因的启动子和第一外显子区域。
iPS优点
• 与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不 同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有 伦理学的问题。
• 利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专用的 干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
We help you discover life
发展历：
• 2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几 乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维 母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。 • 所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子组合，而 Thompson实验室则采用了以慢病毒载体引入OCT4、 SOX2加NANOG和LIN28这四种因子组合。 • 这些研究成果被美国《科学》杂志列为2007年十大科 技突破中的第2位。
iPS缺点
• 比如，添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞 中有缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。
Cyagen Biosciences Inc.
iPS细胞制备流程
1. 分离和培养宿主细胞 2. 通过病毒（逆转录病毒、慢病毒或者腺病毒）介 导的方法将外源基因（oct4、sox2、klf4、cmyc）导入宿主细胞；或者通过非病毒方法将转 录因子DNA、RNA或者重组蛋白质转染到宿主 细胞。 3. 将感染转录因子的宿主细胞转移至饲养层细胞上， 在ES细胞培养液中培养，同时在培养液中加入 一种或者两种小分子物质促进重编程。 4. 筛选ES细胞克隆样的克隆并鉴定
ES细胞中的与细胞多能性有关的基因能够表
达，如：oct4，Sox2等。而已分化的体细胞中的
这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外
源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而使体
细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
iPS细胞的鉴定
• 表面标志分子鉴定
IPS细胞能够表达多能干细胞特异的表 面标志分子，如：ssea-1（阶段特异性胚胎 抗原1），ssea-3等。这些物质在已分化体 细胞表面不表达，从而鉴定。
iPS细胞的鉴定
• 表观遗传状态鉴定
iPS细胞与ES细胞具有相似的DNA甲基 化模式和组蛋白修饰情况。iPS细胞中的多 能基因，如oct-4，Nanong等的启动子区域 CpG岛从高甲基化转变为类似ES细胞的低甲 基化状态。 iPS细胞的多能基因启动子区域具有与 ES细胞相同的高H3K4Me3及低H3K27Me3 水平。
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
人体胚胎干(hES)细胞
• 优点：有潜力在体内发育成任何细胞类型 • 缺点： (1)供体卵母细胞的来源困难, ES细胞建系效率低 (2)免疫排斥反应 (3)ES细胞具有成瘤性 (4)体外保持ES细胞全能性的条件非常复杂 (5)伦理学争论
We help you discover life
iPS发展历程
• 2006年日本京都大学山中伸弥Shinya Yamanaka领导的实验室在世界著名学术杂志《 细胞》上率先报道了iPS的研究。 • 他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录 因子引入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞，发现可诱 导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋 白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类 胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干 细胞极为相似。
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
在中国：
• 2009年，中国科学家于2008年11月利用iPS细胞 培育出小鼠——“小小”
• 中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大 学医学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的 工作表明，利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖 能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞 与胚胎干细胞具有相似的多能性。科学家表示， 这一研究成果表明iPS干细胞或许同胚胎干细胞一 样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。
iPS细胞治疗应用目前面临的一些重要的难题
• iPS细胞高效分化程序的建立 • 基因整合病毒的去除 • 排除iPS来源细胞的肿瘤形成
We help you discover life
干细胞
• 具有无限制自我更新能力、同时也可分化成特定 组织的细胞，在细胞发育过程中处于较原始阶段。 • 包括：胚胎干细胞 成体干细胞（组织干细胞）：几乎所有的 成熟组织中都存在相应的组织干细胞，如上皮干 细胞、 造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、 脂肪干细胞、牙髓干细胞等。
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
Cyagen Biosciences Inc.
Retrovirally encoded transcription factor genes were introduced into mouse embryonic and adult fibroblasts. After integration and expression of the transgenes, the fibroblasts were reprogrammed to pluripotency.
制备iPS细胞导入外源基因使用的载体
一、整合性载体 逆转录病毒（感染分裂期细胞） 慢病毒（感染分裂期和非分裂期细胞） 二、非整合载体 质粒（缺乏在哺乳动物细胞自我复制的能力） Episomal质粒（可在细胞中自我复制） 腺病毒 三、可剪切的整合载体
iPS细胞体内外诱导分化
• • • • • 小鼠iPS细胞分化为神经细胞 人iPS细胞成功培养出血细胞 人iPS细胞分化为心脏细胞 iPS细胞分化为肝细胞 应用iPS细胞获得胰腺器官
（Induced pluripotent stem cell,iPS）
诱导多能干细胞
We help you discover life
主要内容
• • • • • • • 什么是诱导多能干细胞 获取诱导多能干细胞的基本原理 诱导多能干细胞的优缺点 诱导多能干细胞的诱导培养与鉴定 诱导多能干细胞的发展历程 诱导多能干细胞的发展前景 诱导多能干细胞临床应用中存在的问题
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
发展历程
• 2008年，哈佛大学George Daley实验室利用诱导细 胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮 肤细胞转变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、 药物筛选等方面发挥重要作用。 • 美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下定向分 化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。 • 哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞 发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分 泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细 胞，并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利 用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞， 而不必先经过诱导多能干细胞这一步。
• iPS细胞不仅在细胞形态、 生长特性、 干细胞标 志物表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA 甲基化方式、 基因表达谱、 染色质状态、 形成 嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
获取iPS细胞的基本原理
Cyagen Biosciences Inc.
We help you discover life
iPS
• 通过基因转染技术(gene transfection)将某些转 录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构 成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC） 细胞样的多潜能细胞。