诱导多能干细胞
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ES细胞中的与细胞多能性有关的基因能够表
达，如：oct4，Sox2等。而已分化的体细胞中的
这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外
源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而使体
细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。
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iPS细胞的鉴定
• DNA甲基化：DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性 地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，常见于基因的5‘CG-3’序列。DNA的甲基化可引起基因的失活。 • CpG岛：CpG即核苷酸对，CpG双核苷酸在人类基因 组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保 持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。 CpG岛 主要在基因的启动子和第一外显子区域。
（Induced pluripotent stem cell,iPS）
诱导多能干细胞
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主要内容
• • • • • • • 什么是诱导多能干细胞 获取诱导多能干细胞的基本原理 诱导多能干细胞的优缺点 诱导多能干细胞的诱导培养与鉴定 诱导多能干细胞的发展历程 诱导多能干细胞的发展前景 诱导多能干细胞临床应用中存在的问题
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IPS细胞的应用前景
• 用于器官移植 • 建立疾病模型，了解发病机理，如癌症 • 治疗某些遗传病 如：患有镰刀型贫血症的小鼠皮肤成纤维细胞建 立了IPSc，并将其移植到小鼠体内，小鼠的症状 得以缓解。
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iPS细胞治疗应用目前面临的一些重要的难题
• iPS细胞高效分化程序的建立 • 基因整合病毒的去除 • 排除iPS来源细胞的肿瘤形成
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iPS发展历程
• 2006年日本京都大学山中伸弥Shinya Yamanaka领导的实验室在世界著名学术杂志《 细胞》上率先报道了iPS的研究。 • 他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录 因子引入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞，发现可诱 导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋 白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类 胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干 细胞极为相似。
制备iPS细胞导入外源基因使用的载体
一、整合性载体 逆转录病毒（感染分裂期细胞） 慢病毒（感染分裂期和非分裂期细胞） 二、非整合载体 质粒（缺乏在哺乳动物细胞自我复制的能力） Episomal质粒（可在细胞中自我复制） 腺病毒 三、可剪切的整合载体
iPS细胞体内外诱导分化
• • • • • 小鼠iPS细胞分化为神经细胞 人iPS细胞成功培养出血细胞 人iPS细胞分化为心脏细胞 iPS细胞分化为肝细胞 应用iPS细胞获得胰腺器官
iPS缺点
• 比如，添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞 中有缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。
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iPS细胞制备流程
1. 分离和培养宿主细胞 2. 通过病毒（逆转录病毒、慢病毒或者腺病毒）介 导的方法将外源基因（oct4、sox2、klf4、cmyc）导入宿主细胞；或者通过非病毒方法将转 录因子DNA、RNA或者重组蛋白质转染到宿主 细胞。 3. 将感染转录因子的宿主细胞转移至饲养层细胞上， 在ES细胞培养液中培养，同时在培养液中加入 一种或者两种小分子物质促进重编程。 4. 筛选ES细胞克隆样的克隆并鉴定
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在中国：
• 2009年，中国科学家于2008年11月利用iPS细胞 培育出小鼠——“小小”
• 中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大 学医学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的 工作表明，利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖 能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞 与胚胎干细胞具有相似的多能性。科学家表示， 这一研究成果表明iPS干细胞或许同胚胎干细胞一 样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。
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发展历程
• 2008年，哈佛大学George Daley实验室利用诱导细 胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮 肤细胞转变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、 药物筛选等方面发挥重要作用。 • 美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下定向分 化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。 • 哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞 发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分 泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细 胞，并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利 用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞， 而不必先经过诱导多能干细胞这一步。
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发展历程：
• 2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几 乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维 母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。 • 所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子组合，而 Thompson实验室则采用了以慢病毒载体引入OCT4、 SOX2加NANOG和LIN28这四种因子组合。 • 这些研究成果被美国《科学》杂志列为2007年十大科 技突破中的第2位。
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iPS
• 通过基因转染技术(gene transfection)将某些转 录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构 成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC） 细胞样的多潜能细胞。
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Retrovirally encoded transcription factor genes were introduced into mouse embryonic and adult fibroblasts. After integration and expression of the transgenes, the fibroblasts were reprogrammed to pluripotency.
iPS细胞的鉴定
• 表面标志分子鉴定
IPS细胞能够表达多能干细胞特异的表 面标志分子，如：ssea-1（阶段特异性胚胎 抗原1），ssea-3等。这些物质在已分化体 细胞表面不表达，从而鉴定。
iPS细胞的鉴定
• 表观遗传状态鉴定
iPS细胞与ES细胞具有相似的DNA甲基 化模式和组蛋白修饰情况。iPS细胞中的多 能基因，如oct-4，Nanong等的启动子区域 CpG岛从高甲基化转变为类似ES细胞的低甲 基化状态。 iPS细胞的多能基因启动子区域具有与 ES细胞相同的高H3K4Me3及低H3K27Me3 水平。
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人体胚胎干(hES)细胞
• 优点：有潜力在体内发育成任何细胞类型 • 缺点： (1)供体卵母细胞的来源困难, ES细胞建系效率低 (2)免疫排斥反应 (3)ES细胞具有成瘤性 (4)体外保持ES细胞全能性的条件非常复杂 (5)伦理学争论
• iPS细胞不仅在细胞形态、 生长特性、 干细胞标 志物表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA 甲基化方式、 基因表达谱、 染色质状态、 形成 嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。
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获取iPS细胞的基本原理
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干细胞
• 具有无限制自我更新能力、同时也可分化成特定 组织的细胞，在细胞发育过程中处于较原始阶段。 • 包括：胚胎干细胞 成体干细胞（组织干细胞）：几乎所有的 成熟组织中都存在相应的组织干细胞，如上皮干 细胞、 造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、 脂肪干细胞、牙髓干细胞等。
iPS细胞的鉴定
• 基因表达模式和发育潜能鉴定
ES和iPS细胞基因表达谱基本相同。iPS细 胞具有发育为包括神经组织、软骨和柱状上皮 在内的三个胚层的能力，并能参与生殖系统的 发育，这与ES细胞相同。
制备iPS细胞的细胞来源
• • • • • • • 成纤维细胞（皮肤、骨髓） 神经细胞 角质细胞 外周血来源的细胞 脐带血 脐带、胎盘来源的间充质干细胞 患者来源的细胞
iPS优点
• 与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不 同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有 伦理学的问题。
• 利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专用的 干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。
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达，如：oct4，Sox2等。而已分化的体细胞中的
这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外
源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而使体
细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。
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iPS细胞的鉴定
• DNA甲基化：DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性 地添加甲基，形成5－甲基胞嘧啶，常见于基因的5‘CG-3’序列。DNA的甲基化可引起基因的失活。 • CpG岛：CpG即核苷酸对，CpG双核苷酸在人类基因 组中的分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保 持或高于正常概率，这些区段被称作CpG岛。 CpG岛 主要在基因的启动子和第一外显子区域。
（Induced pluripotent stem cell,iPS）
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主要内容
• • • • • • • 什么是诱导多能干细胞 获取诱导多能干细胞的基本原理 诱导多能干细胞的优缺点 诱导多能干细胞的诱导培养与鉴定 诱导多能干细胞的发展历程 诱导多能干细胞的发展前景 诱导多能干细胞临床应用中存在的问题
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IPS细胞的应用前景
• 用于器官移植 • 建立疾病模型，了解发病机理，如癌症 • 治疗某些遗传病 如：患有镰刀型贫血症的小鼠皮肤成纤维细胞建 立了IPSc，并将其移植到小鼠体内，小鼠的症状 得以缓解。
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iPS细胞治疗应用目前面临的一些重要的难题
• iPS细胞高效分化程序的建立 • 基因整合病毒的去除 • 排除iPS来源细胞的肿瘤形成
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iPS发展历程
• 2006年日本京都大学山中伸弥Shinya Yamanaka领导的实验室在世界著名学术杂志《 细胞》上率先报道了iPS的研究。 • 他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这4种转录 因子引入小鼠胚胎或皮肤纤维母细胞，发现可诱 导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋 白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类 胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等都与胚胎干 细胞极为相似。
制备iPS细胞导入外源基因使用的载体
一、整合性载体 逆转录病毒（感染分裂期细胞） 慢病毒（感染分裂期和非分裂期细胞） 二、非整合载体 质粒（缺乏在哺乳动物细胞自我复制的能力） Episomal质粒（可在细胞中自我复制） 腺病毒 三、可剪切的整合载体
iPS细胞体内外诱导分化
• • • • • 小鼠iPS细胞分化为神经细胞 人iPS细胞成功培养出血细胞 人iPS细胞分化为心脏细胞 iPS细胞分化为肝细胞 应用iPS细胞获得胰腺器官
iPS缺点
• 比如，添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞 中有缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。
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iPS细胞制备流程
1. 分离和培养宿主细胞 2. 通过病毒（逆转录病毒、慢病毒或者腺病毒）介 导的方法将外源基因（oct4、sox2、klf4、cmyc）导入宿主细胞；或者通过非病毒方法将转 录因子DNA、RNA或者重组蛋白质转染到宿主 细胞。 3. 将感染转录因子的宿主细胞转移至饲养层细胞上， 在ES细胞培养液中培养，同时在培养液中加入 一种或者两种小分子物质促进重编程。 4. 筛选ES细胞克隆样的克隆并鉴定
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在中国：
• 2009年，中国科学家于2008年11月利用iPS细胞 培育出小鼠——“小小”
• 中国科学院动物研究所周琪研究员和上海交通大 学医学院曾凡一研究员领导的研究组合作完成的 工作表明，利用iPS细胞能够得到成活的具有繁殖 能力的小鼠，从而在世界上第一次证明了iPS细胞 与胚胎干细胞具有相似的多能性。科学家表示， 这一研究成果表明iPS干细胞或许同胚胎干细胞一 样可以作为治疗各种疾病的潜在来源。
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发展历程
• 2008年，哈佛大学George Daley实验室利用诱导细 胞重新编程技术把采自10种不同遗传病患者病人的皮 肤细胞转变为iPS，这些细胞将会在建立疾病模型、 药物筛选等方面发挥重要作用。 • 美国科学家还发现，iPS可在适当诱导条件下定向分 化，如变成血细胞，再用于治疗疾病。 • 哈佛大学另一家实验室则发现利用病毒将3种在细胞 发育过程中起重要作用的转录因子引入小鼠胰腺外分 泌细胞，可以直接使其转变成与干细胞极为相似的细 胞，并且可以分泌胰岛素、有效降低血糖。这表明利 用诱导重新编程技术可以直接获得某一特定组织细胞， 而不必先经过诱导多能干细胞这一步。
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• 2007年末，Thompson实验室和山中伸弥实验室几 乎同时报道，利用iPS技术同样可以诱导人皮肤纤维 母细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的多能干细胞。 • 所不同的是日本实验室依然采用了用逆转录病毒引入 Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4 4种因子组合，而 Thompson实验室则采用了以慢病毒载体引入OCT4、 SOX2加NANOG和LIN28这四种因子组合。 • 这些研究成果被美国《科学》杂志列为2007年十大科 技突破中的第2位。
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iPS
• 通过基因转染技术(gene transfection)将某些转 录因子导入动物或人的体细胞, 使体细胞直接重构 成为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC） 细胞样的多潜能细胞。
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Retrovirally encoded transcription factor genes were introduced into mouse embryonic and adult fibroblasts. After integration and expression of the transgenes, the fibroblasts were reprogrammed to pluripotency.
iPS细胞的鉴定
• 表面标志分子鉴定
IPS细胞能够表达多能干细胞特异的表 面标志分子，如：ssea-1（阶段特异性胚胎 抗原1），ssea-3等。这些物质在已分化体 细胞表面不表达，从而鉴定。
iPS细胞的鉴定
• 表观遗传状态鉴定
iPS细胞与ES细胞具有相似的DNA甲基 化模式和组蛋白修饰情况。iPS细胞中的多 能基因，如oct-4，Nanong等的启动子区域 CpG岛从高甲基化转变为类似ES细胞的低甲 基化状态。 iPS细胞的多能基因启动子区域具有与 ES细胞相同的高H3K4Me3及低H3K27Me3 水平。
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• 优点：有潜力在体内发育成任何细胞类型 • 缺点： (1)供体卵母细胞的来源困难, ES细胞建系效率低 (2)免疫排斥反应 (3)ES细胞具有成瘤性 (4)体外保持ES细胞全能性的条件非常复杂 (5)伦理学争论
• iPS细胞不仅在细胞形态、 生长特性、 干细胞标 志物表达等方面与ES细胞非常相似, 而且在DNA 甲基化方式、 基因表达谱、 染色质状态、 形成 嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。
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干细胞
• 具有无限制自我更新能力、同时也可分化成特定 组织的细胞，在细胞发育过程中处于较原始阶段。 • 包括：胚胎干细胞 成体干细胞（组织干细胞）：几乎所有的 成熟组织中都存在相应的组织干细胞，如上皮干 细胞、 造血干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、 脂肪干细胞、牙髓干细胞等。
iPS细胞的鉴定
• 基因表达模式和发育潜能鉴定
ES和iPS细胞基因表达谱基本相同。iPS细 胞具有发育为包括神经组织、软骨和柱状上皮 在内的三个胚层的能力，并能参与生殖系统的 发育，这与ES细胞相同。
制备iPS细胞的细胞来源
• • • • • • • 成纤维细胞（皮肤、骨髓） 神经细胞 角质细胞 外周血来源的细胞 脐带血 脐带、胎盘来源的间充质干细胞 患者来源的细胞
iPS优点
• 与经典的胚胎干细胞技术和体细胞核移植技术不 同，iPS技术不使用胚胎细胞或卵细胞，因此没有 伦理学的问题。
• 利用iPS技术可以用病人自己的体细胞制备专用的 干细胞，所以不会有免疫排斥的问题。
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