饲用复合酶制剂酶学特性研究

ｐ ６０时脂 肪 酶 、 维 素 酶 和 淀 粉 酶 的催 化 能 Ｈ＝ ． 纤
力 较 强
表 １ Ｄ 值对 纤维 素 酶 促 反 应影 响 Ｈ
纤 维 素 酶 活
７３ ８３ ５ ４
１ ４
２１ ０
温 １ ｍ ｎ 取 出后 立 即加 入 ９ ％乙醇 １ ｍ 以停 ５ ｉ． ５ ５ Ｌ， 止 酶作 用 ， 加 酚酞 指示 剂 ３滴 ， ０ ５ ｏ Ｌ氢 再 用 ． ｍｌ ０ ／ 氧化钠 滴定 至溶 液呈粉 红色 为止 。 计算酶 活 。
保 温显色 ２ ｍｉ 。 吸光 度 Ａ并计 算 酶活 。 ０ ｎ后 测 配制 １１ ．％的淀粉溶 液 ， 节 ｐ 调 Ｈ至 ５ 。取适 ． ０
当稀 释酶 液 ｌ Ｌ与 １１ ｍ ．％的预热 淀粉 溶液 ９ ｍＬ混 合 。分 别 在 ２ ℃ 、０ ４ ｃ 、Ｏ ６ ｃ 的温 度条 ０ ３ ℃、０Ｉ ５ ℃、Ｏ【 二 ＝
以橄 榄 油 为底 物 ， 在一 定 温 度 、 Ｈ值 等 条 件 ｐ 下发 生 酶促 反 应 ． 反应 液 中脂 肪 酸 的增 加 量表 以
示 酶 活力 。脂 肪酶 活 力 的定 义 ： 一定 的温 度 和 在
选 用 Ｓ — 、 ７ ６和 Ｂ 一 ２菌 株 发 酵 ．发 酵 ６５Ｙ — ５ｌ 温 度 ３ ￣ 初 始 ｐ ５０ 接 种 量 １％ 、 酵 时 间 ２Ｃ、 Ｈ＝ ．、 ０ 发 ８ｈ ４ 。混菌 比例 ２ ２ １的条件 下进 行混 菌发 酵 ， ：： 发
倒 广萄２１ 年第４ ００ 期
科技视野
Ｓ－ ｃｎＴｈ， ｕ。 （ ｄｅｎ。 ｔ ｉ ａ ｃ（ ｅ Ｍ ／ ／ Ｏ 。
饲用 复合磕制剂跪学特性研 究
刘秀 花 梁 峰
摘
要 ：饲 用 复 合 酶 制 剂 的 主要 酶 种 包 括 纤 维 素 酶 、
１４ 酶 活 测 定 ．
蛋 白酶 、脂 肪 酶 和 淀 粉 酶 。 利 用 高 产 菌 株 Ｓ — 、 ７ ６和 ６ ５Ｙ — Ｂ — ２混 合发 酵 生 产 复 合 酶 制 剂 ． 现 纤 维 素 酶 催 化 反 应 ５１ 发 最 适 宜 的酸 碱 度 在 ｐ ５０ 反 应 体 系 温度 为 ６ ℃时 ， 维 Ｈ＝ ． ， Ｏ 纤 素 酶活 力 达 到 １ ９ Ｕ ｇ 蛋 白酶 酶 活 在 ｐ ６０时 酶 催 化 ４２ ３ ／ ： Ｈ＝ ． 能力 最 强 ： 脂 肪 酶 和 淀 粉 酶 在 ５ ℃时 催 化 能 力 最 强 ， 而 ０ 在
１ 材 料 和 方 法
ｐ Ｈ值 条件 下 ．每克 样 品 每分 钟 水 解 酪蛋 白产 生 ｌ ｇ酪 氨 酸 所 需 的酶 量 为 １ 蛋 白酶 活 力 单 位 ｌ ｘ 个
（ ／） Ｕｇ 。
１ ． 淀 粉酶 活力 的测 定 （ Ｎ ．３ ４ Ｄ Ｓ法 ）
以淀 粉 为底 物 ， 一 定 温度 、 Ｈ值 等 条 件下 在 ｐ 发 生 酶促 反应 ． 以反 应 液 中还 原糖 的增 加量 表 示
１１ ． ％的 预 热 淀 粉 溶 液 ９ Ｌ混 合 ．０ ｍ ４ ％准 确 反 应
３ ｍ ｎ 取 反 应 液 ｌ Ｌ 迅 速 与 ２ Ｌ的 Ｄ Ｓ溶 液 ０ ｉ． ｍ ， ｍ Ｎ
混 合 。 水浴 １ ｍ ｎ ５ ０ ｍ 处 比色 。测 吸光 度 Ａ 沸 ５ ｉ ，５ ｎ 并 计算 酶活 取 ００ ５ ｏ Ｌ磷 酸 缓 冲 液 ５ ． ｍｌ ２ ／ ｍＬ和 聚 乙 烯 醇 橄 榄 油乳 化液 ４ Ｌ混合 均 匀 ， 节其 ｐ ｍ 调 Ｈ值 分 别 为 ３ 、．、 ．、 ．、．。在 ４ ℃温度 条 件下 保 温 ． ４０ ５０ ６０ ７Ｏ Ｏ ０
蛋 白酶 酶活
脂 肪 酶 酶 活 淀 粉 酶 酶 活
４６ ２ ４ ０
３ ４１
３ ６０ ３ ８
３ｌ ９
４ ℃、０Ｃ、０１ ０ ５ ｏ ６ ＂ 的温度 条件 下恒 温水 浴 ３ ｍ ｎ 取 ２ ０ ｉ， 出后 加 入 Ｄ Ｓ试 剂 ２ Ｌ于沸 水 浴 中显 色 ５ ｎ Ｎ ｍ ｍｉ．
促 反应 的影 响 。 由表 １ 知 ． 维 素酶 催化 反 应 可 纤 最适 宜 的酸碱 度在 ｐ ５ ． 酸性 的反应 条件 接 Ｈ＝ ． 偏 ０ 近 动 物肠 道 酸 性 环 境 ， 因此 ， 以作 为饲 用 纤 维 可 素酶 添加 剂在 动物肠 道 中继 续发 挥催化 作用
蛋 白酶 酶 活在 ｐ ６０时 酶催 化 能 力 最 强 ． Ｈ＝ ．
木 素木 霉 Ｓ — ， 曲霉 Ｙ — ． 草 芽孢 杆 菌 ６５黑 ７ ６枯
Ｂ５ ２。 －１
１ 培养基 ． ２
麸 皮 ７ ｇ豆粉 ５ 、 ０、 ｇ 玉米粉 ９ 、 草粉 ３ 、 ｇ稻 ｇ 硝酸 铵 １、 ｇ 营养盐 １％， ０ 含水 量 ６ ％ ５ 灭菌备用 。 ５ ７ ％，
１３ 酶 液 提 取 ．
ｐ 值条 件 下 ，每 克 样 品 每分 钟 水 解 产 生 １ ｌ Ｈ ｍｏ
游 离脂 肪酸 的酶 量定 义为 １ 酶活 单位 （ ） 个 Ｕ 。
１５ 不 同 ｐ 值 下 的 酶 活 ． Ｈ
酵 产物 于 ４ ℃下 烘 干 ， 碎成 粗 粉 状 ， ０ 粉 混匀 待 用 。
称 取干 酶 曲 １ ，加 入 １ｍＬ柠檬 酸一 檬 酸钠 缓 ｇ ５ 柠 冲 液浸 提 １ ． 滤 得 到粗 酶液 。 相 同 的缓 冲液 ｈ过 用
２１ Ｈ 值 对 复 合 酶 酶 促 反 应 的 影 响 ． ｐ
Ｄ Ｈ值 的改 变 会 明显 改 变纤 维 素酶 的催 化 能
力 。 定酶促 反应 温度 ４ ℃ ． 设 ０ 考察 ｐ Ｈ值 变化对 酶
配 制 １１ ．％的淀粉 溶 液 ， 节 期 ｐ 调 Ｈ值 分 别 为
３０ ４０ ５ … ０ ７０ 取 适 当 稀 释 酶 液 ｌ Ｌ 与 ．、 ．、 ． ６ ．。 ０ ｍ
取 １ Ｍ — ａ 液 ２ ． 节 ｐ 值 分别 为 ％Ｃ Ｃ Ｎ 溶 ｍＬ 调 Ｈ
３ 、 ．、 ．、．、 ．。 加 入 适 当稀 释 纤 维 素 酶 液 ． ４０ ５０ ６ ７０ ０ ０
ｌ Ｌ混 匀 ，在 ４ ℃恒 温 水浴 锅 中催 化 ３ ｍｉ ． ｍ ０ ０ ｎ后 加入 Ｄ Ｓ试 剂 ２ Ｌ于 沸水 浴 中显 色 ５ ｉ ．冷 却 Ｎ ｍ ｍｎ 至室 温 ． 测定 吸光 度 Ａ并 计算 酶活 。 取２ ％酪蛋 白溶 液 ２ ． 节其 ｐ 值分 别 为 ｍＬ 调 Ｈ ３０ ４Ｏ ５０ ６０ ７ 。加 入 适 当稀 释 酶液 ｌ ．、．、 ．、 ．、． ０ ｍＬ混
１６ 不 同温 度 下 的 酶 活 ．
Ｕ ｇ ｍｉ ／・ ｎ
４ ５１ ２
７５ １ ６ １２ ０
ｌ ７ ２６ ５
１ ３ ６２ ４ ２６ ２ ２ ３８ ４
３ ７ ３ ２１
选 取 适 当稀 释 纤 维 素 酶液 ｌ Ｌ与 ｐ ５０的 ｍ Ｈ．
Ｃ — ａ缓 冲液 ２ Ｌ混 匀 ，分 别 在 ２ ℃ 、Ｏ 、 ＭＣ Ｎ ｍ ０ ３℃
１ 茵株 ． １
酶 活力 。淀粉 酶活 力 的定 义 ： 在一 定 的温度 和 ｐ Ｈ 值 条件 下 ， 每克 样 品每 分钟 水 解 淀粉 产 生 １ ｇ麦 ｍ
芽糖 所需 的酶 量为 １ 淀粉 酶活 力单 位 （ ／） 个 Ｕｇ 。
１ ． 脂肪 酶 活力 的测定 （ ．４ ４ 滴定 法 ）
值 和温度条件下 ． 每克样 品每分 钟分解 Ｃ － ａ ＭＣ Ｎ 生 成 ｌＬ 葡萄糖所需 的酶量为 １ Ｉ ． ｇ 个酶 活单 位（ ／） Ｕｇ 。 １ ． 蛋 白酶 活力 的测 定 （ 林试 剂法 ） ．２ ４ 福 以酪蛋 白为底 物 。 一定 温 度 、Ｈ值 等 条 件 在 ｐ 下 发生 酶促 反 应 ． 以反 应液 中酪氨 酸 的增 加 量 表
０ ｍｌ ． ｏ Ｌ三 氯 醋酸 ２ ４ ／ ｍＬ终 止 反应 ． 离心 后 取滤 液 ｌ Ｌ． ０ ｍｏ Ｌ ａＣ ３ｍ 、 林 试剂 ｌ Ｌ 摇 匀 ｍ 加 ． １ Ｎ ｚＯ５ Ｌ 福 ４ ／ ｍ ，
素酶 活最 低 ， 仅有 ６０ ２ ／； ２ Ｕ ｇ 随着 温度 的升高 ， 酶
活力 逐渐 增加 ， 在 ３ ℃ 、０ 但 ０ ４ ℃和 ５ ℃时 ， 活力 ０ 酶 变化不 大 ． 这可 能与产酶 菌种 有关 。 ７ ６和 Ｓ — Ｙ— ６５ 都能 够 产生 高活 力 的纤 维素 酶 ． 由于每 个菌 种产
适 当稀释 测定酶 活
刘 秀 花 ： 丘 师 范 学 院 生命 科 学 系。 商
梁
峰： 单位 同 第一 作 者 。
科技 视 野
３ ４
钢蜊，函２１ 年第４ ００ 期
Ｓ ｉ ｅｎＴｈ１ ｕ。 ｃ ｄｅｎ。 ｔ Ｐ ａ ｃｏ Ｏｌ 。
匀 ．０ ４ ℃恒 温水 浴锅 １Ｉｉ．取 出后 加入 ０４ １ ０Ｔｎ ｌ ． ／ ｍｏ Ｌ
２ 结 果 与 分 析
三氯 醋 酸 ２ Ｌ终 止 反应 。保 温 ２ ｍｉ ．取 滤 液 ｍ ０ ｎ
ｌ ， 加 ０ ｍ １ Ｎ ２Ｏ５ Ｌ 福 林 试剂 ｌ Ｌ， ｍＬ 再 ． ｏ Ｌ ａ ３ｍ 、 ４ ／ Ｃ ｍ 摇 匀 保温 显色 ２ ｍｉ ， 吸光度 Ａ并计 算酶 活 。 ０ ｎ后 测
冷却 至室温 测 定 吸光度 Ａ计 算酶 活 。
２２ 温度 对 复 合 酶 酶 促 反 应 的 影 响 ．
温 度 是 影 响 纤 维 素 酶 酶促 反 应 的重 要 因素
之一 。设 定 Ｄ ５０的条件 下 温度 变 化对 酶促 反 Ｈ＝ ．
取２ ％酪蛋 白 ｌ 。 节 ｐ ｍＬ 调 Ｈ至 ５０ 加 入稀 释 ．．
１ ． ＭＣ酶 活力 的测 定 （ Ｎ ．１ ４ Ｃ Ｄ Ｓ法 ）
以 Ｃ － ａ 为 反应 底 物 ，在一 定温 度 、Ｈ ＭＣ Ｎ 作 ｐ
值 等条件下发 生酶促反应 ． 以反应液 中还 原糖 的增
加 量表示 酶活力 。Ｃ ＭＣ酶 活力 的定 义 ： 定 的 ｐ 一 Ｈ
６ ℃催 化 能力 下降 ． 不 明显 。 ０ 但 关 键 词 ： 产 菌 株 ；Ｈ值 ： 度 ； 合 酶 高 ｐ 温 复
５ ｎ 然 后 各 加 入 适 当稀 释 的酶 液 ｌ ， 确 保 ｍｉ ． ｍＬ 准
当 ｐ 低 于 或 高于 ６０都 会 影 响其 催 化 能力 脂 Ｈ ．
肪 酶 和 淀粉 酶 在 ｐ 为 ５０ ６０和 ７０时差 别 较 Ｈ ．、． ． 小 ， 因此 ， 合 酶 酶 促 反 应 的适 宜 ｐ 值 应 该 在 复 Ｈ ５０ ６０ ｐ ５０时 纤 维 素 酶 催 化 能 力 较 强 ． ．～ ． ，Ｈ＝ ．
示 酶活 力 。蛋 白酶 活力 的定 义 ： 一 定 的温 度 和 在
微 生 物 的 新 陈代 谢 过 程 与 产 酶 过 程 是 相 伴 随的 ． 产酶 的 过程 要求 要 在 一定 的 条件 下 才 能完
成 。 良好 Leabharlann 外 界 环境 有利 于 酶 的形 成 ． 比如合 适
的 温度 、 气 、 Ｈ和 营养 条 件 等 。酶 是 良好 的生 通 ｐ 物催 化 剂 ． 合适 的外 界 条 件能 够 加速 酶促 反 应 的 进行 。探讨 酶促 反应条 件 是合理 使用 酶制 剂 的前 提 ， 是合理 使用 酶制 剂所 必须 的 也
生 的纤 维 素酶 的性 质 有 所不 同 ．因此 造 成 了从
３～ Ｏ Ｏ ５ ℃酶催化 能力 变化 不大 。作 为饲用 酶 。０ ４ ℃ 的催 化条 件可 以延 续 酶 在 动 物肠 道 中 的催 化 作
件 下准 确反 应 ３ ｍｉ． 反应 液 ｌ Ｌ， 速 与 ２ Ｌ ０ ｎ取 ｍ 迅 ｍ 的 Ｄ Ｓ溶 液混 合 ， Ｎ 沸水 浴 １ｍｉ ，５ ｎ 处 比色 。 ５ ｎ５０ ｍ 测 吸光度 Ａ并计 算酶 活 。 取 ００ ５ ｏ门 磷 酸缓 冲 液 ５ Ｌ和 聚 乙烯 醇 ． ｍ ＬＬ ２ ｍ 橄 榄 油乳 化液 ４ Ｌ混合 ， 节 ｐ 至 ５Ｏ 分 别 在 ｍ 调 Ｈ ．， ２ ｃ 、０ 、０ 、０ 、０ 的 温 度 条 件 下 保 温 ０【 ３ ℃ ４ ℃ ５ ℃ ６ ℃ ＝
酶 液 ｌ Ｌ混 匀 。分 别 在 ２ ℃ 、０ 、０ 、Ｏ 、 ｍ ０ ３℃ ４ ℃ ５℃
应 的影 响 由表 ２可知 ． 当反应 体 系温 度为 ６ ℃ Ｏ
时 ． 维 素酶 活力 达 到 １ ９ Ｕ ｇ 在 ２ ℃时 纤维 纤 ４２ ３ ／； ０
６ ℃的温度 条 件 下恒 温水 浴 １ｍｉ ．取 出后加 入 ０ ０ ｎ