霉学 第三章 固定化酶

二、固定化酶的制备方法
• (一) 吸附法 • （二）包埋法 • （三）共价结合（偶联）法 • （四）交联法 • （五）四种固定化酶制备方法的特点小结
Hale Waihona Puke 固定化酶的制备方法的选择• 固定化酶的制备方法、制备材料多种多样， 不同的制备方法和材料，固定化后酶的特 性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自 身的性质、应用目的、应用环境来选择固 定化载体和方法。
（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固 定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶 能有效回收贮藏，利于反复使用。
（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这 要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度， 才能使之在制备过程中不易破坏或受损。
（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应 尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效 率和产物的量。
世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAESephadex A-25吸附的氨基酰化酶反应用于
DL-AA的光学分析。
（二）、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：
将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ：
先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的 酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就 在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高， 并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联 到高聚物上，可以减少酶的脱落。
固定化酶
（Immobilized Enzyme）
酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而 且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。
针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶 或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚 在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃 的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度
条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团的 相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚 糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如 Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
1.影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:
1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度
增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比
第三章 固定化酶及酶的固定化
• 固定化酶、是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束 的酶。近代工业化利用始于1969年固定化氨基酰化酶的 应用。利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题， 为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶能反复使 用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续 化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展 。其新 的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域 宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。
次级键相互作用
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸 附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上 也最具有吸引力。
根据吸附剂的特点又分为两种：
物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键
等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、 微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有 机吸附剂。
小分子慢得多。 6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越
强。多孔性载体，要考虑吸附对象的大小 和总吸附面积的大小。
2.吸附法的优点、缺点
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多， 吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的 固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落， 会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。
海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提 取出来，可被多价离子Ca2+、Al3+凝胶化 ，操作简单经 济。
K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属 离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化 的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。
胶原和明胶也是常用的包埋载体。
2、微囊化包埋法
• 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶 囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业 使用 。
（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程 中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生 化学反应。
（6）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考 虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的， 以利于工业使用。
• 吸附法 • 包埋法 • 共价结合法 • 交联法
(一)、吸附法
吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体上 而使酶固定化的方法。
一、固定化酶的概念
• 固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内 进行催化反应的酶。
固定化酶的优点：
（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用； （2）固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同
时也省去了热处理使酶失活的步骤； （3）稳定性显著提高； （4）可长期使用，并可预测衰变的速度； （5）提供了研究酶动力学的良好模型。
在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。
（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中 心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质 分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损 害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下 发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又 要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。
这就要求酶与载体的结合部位不应当是酶的 活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参 与固定化反应；另外，由于酶蛋白的高级结 构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维 持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条 件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏 的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等 处理。