芯片数据的基本处理和分析

GenMAPP
一款将芯片数据和代谢途径结合起来的图形化显示工具
Why Pathway Analysis?
Intuitive to Biologists
• • • • Provide a biological context for results More efficient than searching databases gene-by-gene Intuitive data display for sharing data Analyze over-representation of changed genes on pathways and ontologies Generate and compare pathway signatures between models
Express Converter主界面：
ExpressConverter使用方法：
1. 2. 3. 选择“Input Format→GenPix”,指定输入的文件格式; 选择“File→Select input files”，选定一个或多个需要转 换的文件; 选择“File→Start converting”，格式开始转换。
good
芯片内的数据标准化 （Normalization）
由于样本差异、荧光标记效率和检 出率的不平衡等因素，需对cy3和cy5的 原始提取信号进行均衡和修正才能进一 步分析实验数据，Normalization正是基 于此种目的。
MIDAS 可选的数据处理方法
• 标准化处理方法 Total Intensity normalization Ratio Statistics normalization Standard deviation regularization In-slide replicates analysis MA-ANOVA
TIGR TM4:
A package of Open Source software programs for Microarray analysis
（ http://www.tm4.org/ ）
芯片数据采集（读取扫描图）
数据基本处理
存储整理芯片数据（数据库）
芯片数据分析结果的图形显示
GenePix格式（.gpr）
芯片数据聚类分析和差异表达基因筛选
基因表达研究中通常假设表达水平相似的基 因可能参与相同或相似的生物学过程，因而它们 具有相似的基因表达谱。 例： 在临床或诊断学等领域中，为研究某些 疾病的发生机制，通常对正常组织和肿瘤组织细 胞间的基因表达情况作比较分析，从中筛选出具 有显著差异的表达基因。
下载地址：http://www.tm4.org/mev.html 。 此程序不用安装下载后解压就可以使用（需要先安装Java） 进入软件所在的文件夹（免安装），双击打开TMEV.bat文件，会出现后台 运行窗口和图形界面窗口。
• 使用ExpressConverter将testdata.gpr转换成 testdata.mev和testdata.ann。 • 用记事本查看testdata.gpr，testdata.mev和 testdata.ann。
ExpressConverter快捷方式： “开始”→“所有程序”
testdata.gpr：C:\Program Files\ExpressConverter\samples\
实习三： 芯片数据的基本处理和分析 王斌
王 丹 阮 陟 胡望雄
浙江加州国际纳米技术研究院(ZCNI)
课程内容
实习一 实习二 基因组数据注释和功能分析 核苷酸序列分析
基因组学 系 统 生 物 学
实习三
实习四 实习五 实习六
芯片数据的基本处理和分析
蛋白质结构与功能分析 蛋白质组学数据分析
转录物组学
蛋白质组学
Flags in Mev file:
• • • • A – 0 non-saturated pixels in the spot B – 0-50 non-saturated pixels in the spot C – 50 or more non-saturated pixels in the spot X – spot is rejected, due to spot shape and intensity relative to background • Y – background is higher than spot intensity • Z – spot not detected by Spotfinder
3 使用SAM查找差异表达基因
①
② ③
不同实验类型
样本分组
④
⑤
SAM结果：Expression Images
SAM结果：Centroid Graphs
SAM结果：Expression Graphs
SAM结果：Table Views
课堂练习
• 使用MeV处理TDMS_format_sample.txt ，并查看结果文件； • MEV程序位置：C:\zcni\shiyan3\MeV_4_6，双击TMEV.bat 打开程序； • 输入文件TDMS_format_sample.txt位于： C:\zcni\shiyan3\MeV_4_3\data\。
GenMAPP基本概念
• MAPP：描述了模式生物的代谢途径图。 目 前 MAPP 数 据 库 中 包 含 了 人 (H.sapiens) 、 小 鼠 (M.musculus)、大鼠 (R.norvegicus)、酵母 (S.cerevisiae)、 线虫 (C.elegans)、狗 (C.familiaris)、鸡 (G.gallus)、牛 (B.taurus)、果蝇 (D.melanogaster)和斑马鱼 (D.rerio)等 模式生物。
TIF 扫描图 对照 mRNA
RT Cy3 Cy3-cDNA RT Cy5 cDNA array Cy5-cDNA
样本 mRNA
对照基因(reference gene)：绿色荧光标记(G) 样本基因(sample gene)：红色荧光标记(R)
区块(block)
信号杂交的一些概念
背景
探针区域
饱和区域 非饱和区域
Step 3：标准化（包括区块间的均一化）
Step 4：结果文件的输出
Biblioteka Baidu
MIDAS统计作图（MIDAS Investigation窗口查看）
log-ratios histogram(.his)
Intensity plot (.ity)
Intensity plot (.lty)
R-I (.prc)
MeV 4.6.2支持的文件格式
• • • • • • MIDAS MEV, TAV 格式 表格格式 GEO格式 Affymetrix格式 GPR格式 Agilent格式
MeV 4.6.2程序主界面
常用工具栏
结果界面
导航栏
芯片数据聚类分析和差异表达基因筛选
1 表格格式数据的读入与转化
2 系统聚类法对基因和样本聚类 3 使用SAM（significance analysis for microarrays）查找差异表达基因
Agilent 格式 （.txt）：
MEV文件：MEV格式的芯片数据
Express Converter: 芯片数据的格式转换
下载地址：http://www.tm4.org/programs/ExprConvt2_1.zip； 下载后，解压安装即可。 “开始” －>“所有程序”处打开。 需要先安装Java，Java下载地址：http://www.java.com;
Computation on Pathway Content
•
GenMAPP安装和更新
• 下载地址： http://www.genmapp.org； • 双击安装文件安装GenMAPP； • 打 开 GenMAPP 程 序 ， 从 菜 单 “ Data → Download Data from GenMAPP.org” 下 载自 己 感 兴趣 物 种 的 MAPP文件和Gene Database。
MIDAS: 数据基本处理
下载地址是：http://www.tm4.org/midas.html
此程序不用安装下载后解压就可以使用。（需要先安装Java）
进入文件夹，双击打开Midas.bat文件，会出现后台运行窗口和图形界面窗口。
低质量数据过滤
• 根据Flag过滤
• 根据信号和背景值过滤
MEV文件：MEV格式的芯片数据
①
1 表格格式数据的读入与转化
1 选择“File→Load Data”弹出导 入数据对话框
③ ②
④
⑤
⑥
数据起始位置
不同颜色表示相对表达量 样本名
基因名
Heatmap View
2 系统聚类法对基因和样本聚类
①
②
聚类分析结果图：
存储和注释感兴趣的分类：
①单击鼠标左键选中目标分类使其高亮化； ②右键选择菜单中的Store Cluster，并设置注释的名称和颜色等信息。
LOWESS (Locfit) normalization
Iterative linear regression normalization Iterative log mean centering normalization • 低质量数据过滤方法 Flip-dye consistency checking Ratio Statistics confidence interval checking Invalid-intensity checking Cross-file-trim • 差异表达基因识别方法 Slice analysis (non-statistical) Cross-slide replicates t-test (statistical) Cross-slide one-class SAM (statistical)
待状态栏显示“Converting is successful”后， 格式转换完 成。此时在原genepix存放的文件夹中会出现文件名相同 但扩展名不同的.mev和.ann的文件。
input
output
程序运行前
程序运行结果
MEV文件：MEV格式的芯片数据
MEV注释文件（后缀名为.ann）
课堂练习
区块间均一化处理
用MIDAS处理单张双色芯片的基本流程
1. 2. 3. 4. 芯片数据的读入； 低质量数据的过滤； 标准化（包括区块间的均一化）； 结果文件的输出。
MIDAS 程序主界面
可选的数据处理步骤
各个处理步骤的相应参数
数据分析 流程设计
程序运行状况显示
Step 1：芯片数据的读入
Step 2：低质量数据的过滤
Box plot (.box)
课堂练习
• 使用MIDAS处理testdata.mev，并查看结果文件； • MIDAS程序位置：C:\zcni\shiyan3\MIDAS2_19，双击 Midas.bat打开程序； • 输入文件testdata.mev由ExpressConverter产生，在 C:\Program Files\ExpressConverter\Samples\。
Low intensity filter Spot QC flag checking Signal/Noise checking
芯片内的数据标准化（Normalization）
A
A
MA plot
M=log2(R/G)
A=log2√R*G
In many microarray gene expression experiments, the general assumption is that most of the genes would not see any change in their expression. Therefore the majority of the points on the y axis (M) would be located at 0, since log(1) is 0.
系统生物学软件实习
芯片数据分析的一般流程：
1. 芯片杂交实验 ，芯片数据采集（读取扫描图） 2. 数据基本处理 3. 数据提交公共数据库 4. 数据生物信息学分析
实习内容：
• TIGR TM4 软件的介绍和使用 • GenMAPP软件的介绍和使用 • GEO数据库的介绍
常见的双通道（dual channel）实验流程：