电化学酶联免疫传感器的发展概述_刘梦琴

% 常用于电化学酶联免疫传感器的标记 酶及其在分析测试中的应用
标记酶的选择能直接影响分析的灵敏度和 精确度。理想的酶应该具有纯度高、 价格低廉、 催 化反应的转化率快、 专一性强、 易于标记和保存、 稳定性好、酶的活力易于测定等特点。常用于电 化学酶联免疫传感器的标记酶列于表 ,。 在这些酶中，最常见的是辣根过氧化氢酶 （’()） 和碱性磷酸酯酶 7 8) 9 。 辣根过氧化氢酶（’()）是广泛研究的一个 过氧化物酶，它以血红素为氧化还原中心。由于 来源方便、提纯容易和结构已知，’() 酶经常作 为典型代表用于研究过氧化物酶分子的结构，动 力学和热力学性质。它的生理作用是催化 ’* +* 还原以及以 ’* +* 为中间产物的众多底物的 , 电 子氧化。’() 修饰电极广泛用于分析 ’* +* 、 有机 过氧化物、酚类化合物、芳香化合物以及一些环 境污染物。 碱性磷酸酯酶 7 8) 9 是一种含 :; 的金属酶，
与开发呈现突飞猛进的局面，各类传感器应运 而生。(,,% 年 ?"JJH 等 _ ( ‘ 提出了免疫传感器的概 念。免疫传感器 _ + ‘ 将高灵敏度的传感技术与特异 性的免疫反应结合起来，用以监测抗原 ) 抗体反 应的生物传感器。抗原 ) 抗体结合前后可导致多 种信号的改变， 如： 质量、 光学、 电化学、 热学等方 面。根据换能器不同， 可分为电化学免疫传感器、 质量检测免疫传感器、热量检测免疫传感器、光 学免疫传感器等。
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压电测量式 严格而言，压电传感器主要是属于质量型。
反应在电极 6 溶液界面发生时，形成的免疫复合 物改变了电极 6 溶液界面的介电性质，增加了界 面厚度和降低了界面的介电常数，使电极 6 溶液 界面电容降低，从而定量测定蛋白质。电容测量 式可直接高灵敏进行免疫测定，故这一类型的酶 联免疫传感器报道甚少。
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" 电化学酶联免疫传感器的概念与基本 原理
电化学酶联免疫传感器是将抗原、抗体的免
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学
传
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疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起 来的一种融合性技术。它的基本原理是通过化学 或生物方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶 标记物或通过免疫学的方法将酶与抗酶体结合 起来，形成免疫复合物，这些酶标记物或免疫复 合物仍保持其免疫活性，然后它与相应的抗原或 抗体反应， 形成酶标记的或含酶的免疫复合物。 结合在免疫复合物上的酶遇到相应的底物 时， 催化其发生水解、 氧化或还原反应， 或形成共 价键结合点，通过电化学分析方法进行定性、定 量测定。可用作电化学免疫分析的生物酶及反应 体系必须满足以下条件： ! " # 酶具有高活性； ! $ # 容易与抗体或抗原结合， 而不降低活性； ! % # 在检测和保存条件下稳定； ! & # 在测定条件下体系底物非活性； ! ’ # 酶催化反应产物具有电化学活性。
但因其传感器件与电化学测量器件组成有一定 相似性，有时也将其归属在广义的电化学传感器 中。压电式酶联免疫传感器的基本原理是在晶体 表面包被一种抗体或抗原，样品中若有相应的抗 原或抗体，则与之发生特异性结合，从而增加了 晶体的质量并改变振荡频率，频率的改变与待测 抗原或抗体浓度成正比。它具有灵敏度较高、选 择性好、 响应快、 小型简便等特点。论文 - ., / 将抗 012 抗体通过氨基烷基化层共价固定在石英晶片 上，采用竞争免疫分析形式， ’() 3 012 作示踪 剂， 结合到晶片上的 ’() 3 012 催化氧化 425 生 成不溶性二聚物沉淀，使晶片表面质量增加，晶 片谐振频率降低，从而测定 ’() 酶的活性。 不 过 - .* / 除了质量外， 一些其它因素如温度、 压力和 表面导电性引起的非特异性问题使得这类传感 器的设计受到了限制。且由于压电传感器本身具 有较高的灵敏度，可直接测量电极表面结合的抗 原或抗体的量，因此，相关压电式酶联免疫传感 器报道较少，以上借助特异性酶催化反应进行信 号放大是该方面研究的主要内容。这一模式在小 分子抗原的测定上尤其具有重要的意义。 !" $ 电容测量式 一种建立在双电层理论上的高灵敏度的 免疫传感器。将抗体固定在电极表面上，当免疫
( "0 +
用乳糖酶标记物作示踪剂， 通过竞争免疫分
析形式测定胰岛素抗体，乳糖酶能催化电极上的 氧化还原反应，从而使电极电位发生改变。常用 的离子选择电极如氟离子电极、 碘离子电极， 气敏 电极如 ?@% 、 .A$ 、 A$ 等都可以作为转换器应用酶
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刘梦琴等： 电化学酶联免疫传感器的发展概述
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电化学酶联免疫传感器的种类
电导测量式 采用酶标记技术，通过免疫反应和酶催化反应
的放大效应，使溶液中的离子种类或数目发生改 。 （ 通常将一种酶固定在某种贵重金属电极上 金、
(% ) * +
变， 从而改变溶液的导电性而达到检测目的
银、 铜、 镍、 铬） ， 在电场作用下测量待测物溶液中 电导率的变化。如用尿酶标记二抗
器的概念与工作原理。根据检测换能器的不同进行了分类比较， 并分别阐述了各种电化学酶联免疫传感器 的工作原理与特点。综述了近年来常用于电化学酶联免疫传感器的标记酶及其在分析测试中的应用。 关键词：酶联免疫传感器；电化学分析
+ ,-../01 23,40567589 8: 23;3<86.397 59 3<347084=3.54/< 39>1.3 ? <59@32 5..-98,39,80
(,+
， 用来放大
溶液的电导率的变化来完成对 -./ 的检测， 灵敏 度为 %0 1234 5 6， 传感器的响应时间为 %0 7。这类 免疫传感器受待测样品中离子强度等非特异因 素影响较大， 故该类传感器发展比较缓慢。 !" ! 电位测量式 电位型酶联免疫传感器是基于离子选择电 极原理而发展起来的 ( 8 ) 9 + 。 在零电位下，酶催化反应生成离子产物，能 引起电极表面电位发生改变，电位与活性物质浓 度对数值成正比， 其关系遵循能斯特方程。因此， 电位型免疫传感器灵敏度一般不高。 :; /-<=><4<7 等
电化学酶联免疫传感器是近年来发展起来
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引言
自上世纪 *% 年代以来，生物传感器的研究
的一项新技术，它是将酶电极的化学放大作用与 免疫电极的特异性相结合，具有免疫反应的特异 性和电化学分析的灵敏性。电化学酶联免疫传感 器具有检测设备相对简单，使用方便，构制酶电 极方法灵活， 体系容易集成化， 微型化等优点。发 展新型电化学酶联免疫传感器是目前较活跃的 研究领域。
原作示踪物， ’* +* 作底物。通过免疫反应结合到 电极表面上的 ’() 酶能催化 ’*+* 的电化学还 原，导电聚合物在酶和电极之间起传递电子的作 用，而未参与免疫反应的溶液中游离态酶标物不 能催化 ’* +* 电化学还原，不影响分析信号的产 生，省去洗脱和更换溶液等步骤，简化了分析过 （图 , ） 程 。
联免疫分析中""" ) "’ + 。 电位型酶联免疫传感器的不 足之处是： 较低的信号 5 噪声比， 线性范围窄， 易 受其它离子干扰。 !" $ 电流测量式 电流型酶联免疫传感器是在恒定电压下监 测由于抗原抗体结合或继后反应中电流的变 化。该类传感器应用广泛，有持久和广阔发展 空间，是电化学酶联免疫传感器发展的重要方 向 ( "* ) $0 + 。 如用来测定茶碱、 /:B: ( $" + 、 :CA D E ( $$ + 、 葡萄球菌抗原、 硝化细菌 ( $% + 等。 @B7:F、 "980 年 :<GHIH 将 :JC 抗体固定在醋酸纤 膜上，并将此膜紧贴电流型氧电极的透氧膜表 面， 用过氧化氢酶标记 :JC， 竞争法检测。:JC 线 性范围达到 "0 D "" ) "0 D 8 F 5 26。该法易受样品溶 解氧及 1@ 的影响， 工作电位高， 背景干扰较大。 改用电活性物质如酪胺衍生物、二茂铁衍生物、 苯醌等， 基本上克服了上述问题。 如 .<H=H ( $& + 选择 对羟基磷酸苯为碱性磷酸酶的底物，结合流动注 射分析， 使 :JC 检测下限达到 0; 0, =F 5 26。 根据酶标记物是否分离，将电化学酶联免疫 传感器分为均相免疫分析法和异相免疫分析法。 $; %; " 均相免疫分析 均相免疫分析在溶液中进行，不须分离。基 本原理是酶 标记抗原 :F ! 与抗体 :K 反应形成 :F!; :K 后，它的催化活性减少。待测的抗原 :F 浓度高， 则游离的 :F! 量就 :F!; :K 复合物就少， 多， 同时， :F!中标记酶的活性高于复合物 :F!; :K 中标记酶的活性，催化效果更明显，响应电流越 均相法操作比较 大， 从而间接测定抗原 :F 的量。 简单， 灵敏度较低， 易受干扰。 $; %; $ 异相免疫分析法 异相免疫反应是在相界面进行，反应完成 后， 需进行洗脱， 消除弱吸附， 该方法背景干扰较 小， 但洗脱过程较费时。目前， 人们逐步发展了 无需分离的异相免疫分析技术，简化了免疫分 析过程，这 方 面 已 有 报 道 ( $’ ) %0 + 。 L<M-; N; OP-QHR 和 STR23=>; O; ?<T>KH4H 等报道了无需分离的竞 争型异相酶联免疫分析，以酶及生物素标记的抗 体作示踪物，它与待测的抗体竞争地吸附到固定 有抗原的乳胶板上，未参与免疫反应的示踪物由 于生物素与亲合素之间强烈的相互作用而结合 到固定有亲合素的乳胶板上，这部分酶标物中的
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酶由于生物素—亲合素相互作用而失活。在酶的 底物溶液中，只有参与免疫反应的酶标物能催化 酶底物的反应而产生响应信号，未参与免疫反应 的酶标物因失活而无需再分离洗脱。!"##$%& 等发 展了基于导电聚合物修饰电极构制的无分离酶 联免疫传感器。抗体通过导电聚合物固定在电极 表面上，采用异相竞争免疫分析法，’() 酶标抗
第 +& 卷第 ( 期 +%%&年’月
化学传感器
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电化学酶联免疫传感器的发展概述
刘梦琴 (. + . 黄 勇 ( . 刘阳新 ’ ，蒋健晖 ( !
! "# 化学生物传感与计量学国家重点实验室 $ 湖南大学化学化工学院，湖南长沙 %"&&’( ) ! (# 衡阳师范学院化学系，湖南衡阳 %("&&’ ) ! *# 中国电子科技集团第 %’ 研究所，湖南长沙 %"&""" ) 摘 要：电化学酶联免疫传感器广泛应用于临床检测、 生化分析等领域。该文介绍了电化学酶联免疫传感